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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离恶性疟原虫pfs25膜蛋白的免疫原性研究
目的:研究聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化的pfs25蛋白的免疫原性变化.方法:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离了毕赤酵母表达的恶性疟原虫pfs25膜蛋白,按照常规程序将分离的pfs25膜蛋白免疫小鼠,以验证其免疫原性.通过荧光光谱分析、酶联免疫吸附实验,分析了聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中pfs25蛋白质免疫原性的变化情况.结果:SDS-PAGE方法成功分离了pfs25蛋白,免疫小鼠后不能产生特异性抗体;与pfs25标准品相比,纯化的pfs25蛋白的荧光光谱发生了改变,但是ELISA结果均为阳性.结论:聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化的pfs25蛋白保留了其免疫反应性,丧失了免疫原性.
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不同的化学连接剂偶联恶性疟原虫Pfs25抗原和绿脓杆菌重组去毒外毒素rEPA
偶联恶性疟原虫Pfs 25抗原和绿脓杆菌重组去毒外毒素rEPA,并测试不同化学连接剂的偶联效果.方法 用化学连接剂NA HT (DL-N-acetylhomocysteine thiolactone)在Pfs25蛋白上加自由巯基,化学连接剂Sulfo-EMCS、EMCH、SBAP和Sulfo-SIAB分别修饰载体蛋白rEPA,通过巯基化的Pfs25和经化学基团修饰的rEPA在一定条件下反应,形成Pfs25与rEPA的偶联蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测偶联结果. 结果 成功地将Pfs25偶联到rEPA上,构建了偶联蛋白Pfs25-rEPA.对于蛋白的化学基团修饰,伯胺基与NHS(N-hydroxysuccinimide)酯之间的反应效率要高于以EDC为桥联剂的羧基与酰肼基之间的反应;对于偶联反应,马来酰亚胺基与巯基之间的反应效率要高于卤素乙酰基与巯基之间的反应.结论 各化学连接剂都能将Pfs25偶联到rEPA上,但偶联效率各不相同,并形成不同样式的偶联蛋白.
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构建真核表达载体实现恶性疟原虫膜蛋白pfs25在CHO细胞中的重组表达
构建一种可实现外源基因高效的、适用于中华仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞的质粒表达系统,并成功实现了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因在CHO细胞中的表达.新构建的真核表达载体是在pBudCE4.1质粒载体上改造获得的,被命名为pCMV-WD,包含了人工合成的、完整的弱化SV40启动子与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因组成的顺式表达元件和全新设计的多克隆位点,该载体属于CHO细胞通用载体,理论上可以实现任何外源基因在CHO细胞中的表达.基于该载体,采用定向克隆策略插入了恶性疟原虫膜蛋白pfs25基因,构建的重组表达质粒为pfs25/pCMV-WD.经zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选,获得了DHFR+基因阳性的细胞克隆.对表达量高的克隆株进行亚克隆,并经MTX加压筛选以获得高表达pfs25蛋白的CHO细胞株.ELISA和Western Blot结果表明,重组pfs25蛋白具有良好的免疫学反应性,且表达量为0.1 mg/mL.该研究首次获得了可分泌重组pfs25蛋白的CHO细胞株.
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恶性疟原虫云南株PFD-3／YN Pfs25基因的测序及同源性分析
目的了解恶性疟原虫云南株PFD-3／YN pfs25基因序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫云南株PFD-3／YN株pfs25全基因，经Sanger双脱氧链终止法测序和PstI酶切鉴定，并与国外恶性疟原虫NF4株pfs25进行比较。结果恶性疟原虫云南株PFD-3／YN株pfs25基因与NF4株的pfs25基因其同源性为99.2％。结论 PFD-3／YN株与NF4株pfs25基因表现很高的同源性。
