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人、黑猩猩和叶猴FKN全基因的克隆及体外表达的比较研究
目的:克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因及体外表达,比较研究FKN在进化过程中基因组水平和蛋白表达水平的差异.方法:应用基因重叠延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE-PCR)将FKN的3个外显子编码序列依次进行前后拼接,然后插入pcDNA3.1/myc-His(-)A真核表达载体中,经酶切、测序鉴定后转染CHO细胞体外表达,RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物.结果:酶切、测序鉴定证实插入的基因片段为完整的FKN,RT-PCR可从转染的CHO细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段,其表达蛋白能分泌至胞外,SDS-PAGE显示其分子量约为95 000,抗c-myc抗体可与载体上的c-myc蛋白特异性结合.测序显示人、黑猩猩和叶猴相比,FKN基因除了有散在的点突变外,还发现有一明显的30 bp的缺失,但此缺失对FKN蛋白的表达并不影响.结论:成功克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因,基因组水平和蛋白表达水平的比较研究为后续探讨FKN在高级灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变奠定基础.
关键词： FKN 基因重叠延伸拼接PCR 基因克隆 灵长类 -
Reg Ⅳ基因缺失CRD 结构域片段获得及其表达载体的构建与转染
目的: 探讨应用基因重叠延伸拼接PCR (SOE-PCR)技术构建Reg Ⅳ基因缺失CRD 结构域表达载体,并转染Reg Ⅳ低表达结直肠癌细胞系.方法: 应用SOE-PCR法获得Reg Ⅳ缺失CRD 结构域片段,构建真核表达载体并转染Reg Ⅳ低表达结直肠癌LoVo细胞,G418筛选,RT-PCR检测鉴定.结果: 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功,经pcDNA3.1-Reg Ⅳ-domain△转染的LoVo细胞Reg Ⅳ-domain △呈阳性表达.结论: 利用SOE-PCR技术可成功构建Reg Ⅳ基因缺失CRD 结构域的表达载体.
关键词： Reg Ⅳ 碳水化合物识别域 结直肠癌 基因转染 基因重叠延伸拼接PCR
