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应用AdMax系统构建携带HCV核心基因Core的重组腺病毒载体
目的 应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础.方法 RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCV Core基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量.结果 重组腺病毒pad-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致.扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034 IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞.结论 已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒Core与NS3基因的不同融合方式及其表达
丙型肝炎病毒(简称HCV)是危害人类健康的传染性疾病,预防该病的传播主要借助于HCV血清学诊断来筛选献血员和检测临床标本.从国内外已分离到的HCV株得知,HCV核心蛋白(Core)和非结构蛋白NS3含有较强的优势抗原表位,其相应的抗体出现早,阳性率高,已成为目前第二、第三代HCV免疫诊断试剂的重要成份[1,2].通常Core蛋白和NS3蛋白分别用基因工程方法表达,然后作为固定化抗原,检测人体内HCV的抗体.我们对Core和NS3的两种不同组合方式及其表达的研究,对于发展新的HCV诊断试剂很有帮助,现将结果报道如下.
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丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core的构建
目的 构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core,为进一步研究外部引导序列(external guide sequence, EGS)引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础.方法 将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增;提取pBRTM/HCV1-301l质粒;从pBRTM/HCV1-301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM-3Z克隆载体;以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体;后EcoR I and Hind III双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体.结果 pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV 核心基因片段大小相符;经测序证明其插入序列与HCV core基因序列一致.结论 成功构建了HCV 核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core.
