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牛传染性鼻气管炎病毒gC结构蛋白的真核表达及其反应原性分析
目的 真核表达牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gC结构蛋白,并对其反应原性进行鉴定.方法 以GenBank中登录的IBRV基因序列合成gC基因全长,构建重组真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并进行双酶切鉴定.将鉴定正确的质粒转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gC蛋白,经Dot blot和间接免疫荧光法鉴定其反应原性.结果 质粒pCDNA4-gC-His经双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组gC蛋白相对分子质量约54 000,纯化后的浓度为0.03 mg/mL,可与IBRV免疫的兔多抗发生反应.结论 成功构建了真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并能在MDBK细胞系中正确表达,表达的蛋白与天然IBRV gC蛋白具有相同的反应原性,为后续免疫学诊断方法的建立奠定了基础.
关键词： 牛传染性鼻气管炎病毒 gC蛋白 真核表达 反应原性 -
IBRV TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法在BVDV和IBRV共感染中病毒定量检测的应用
目的 应用牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法进行牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和IBRV共感染的病毒定量检测,进一步研究BVDV和IBRV共感染后BVDV对IBRV复制的影响.方法 分别用0.2和1.0 MOI的BVDV感染MDBK细胞,待细胞出现50％ CPE时,再用0.1 MOI的IBRV共感染,作用24 h后收集样品,采用Taqman-MGB实时荧光定量PCR方法检测IBRV的拷贝数,并与对照组(IBRV单独感染组)进行比较.结果 在先感染0.2和1.0 MOIBVDV情况下,IBRV拷贝数分别为3.0× 106和6.47×106拷贝/μL,单独感染IBRV的对照组的拷贝数为1.15×107拷贝/μL.结论 在体外情况下,BVDV对IBRV的复制影响较小,为研究BVDV和IBRV的共感染机制以及制备BVDV和IBRV感染同一细胞的二联苗奠定了基础.
关键词： 实时荧光定量PCR 牛病毒性腹泻病毒 牛传染性鼻气管炎病毒 共同感染 病毒载量 -
牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gE蛋白的单克隆抗体,并进行鉴定.方法 将扩增的IBRV gE基因插入至载体pET-32a(+),转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白IBRV gE,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞.经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,3×106个/只,待小鼠腹腔膨大后,采集腹水,硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,并进行亚类、浓度、染色体数目、Western blot及间接免疫荧光检测.结果 重组蛋白IBRV gE相对分子质量约35 000,纯化后浓度为1.2 mg/mL.小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,筛选出1株稳定分泌IBRV单抗的杂交瘤细胞(命名为3G9),获得相应抗体浓度为1.46 mg/mL;为IgG1亚类,轻链为kappa链;染色体数目为95 ～ 105;可与IBRV发生特异性反应;可与接种IBRV毒株的MDBK细胞发生特异性结合,产生特异性荧光.结论 采用原核表达系统表达并纯化了IBRV gE蛋白,成功制备了抗IBRV gE的单克隆抗体,为建立特异性的IBRV诊断方法及致病机理的研究奠定了基础.
关键词： 牛传染性鼻气管炎病毒 gE蛋白 单克隆抗体 -
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定.方法 将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPrG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠.取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用HiTrap Protein GHP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测.结果 重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml.小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光.结论 本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础.
关键词： 牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白 单克隆抗体
