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尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定
利用改造的昆虫杆状病毒表达系统转移载体,成功地对尼帕病毒(NiV)和亨得拉病毒(HeV)的核蛋白基因进行了分泌表达.重组蛋白表达的时效性分析结果显示,Sf9细胞感染重组病毒72~96h后,蛋白的表达量达到高峰,大规模表达可分别获得2.3~2.4mg/L纯化的目的蛋白.应用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)对两种重组N蛋白与兔抗NiV和HeV阳性血清的反应性进行鉴定,结果表明两种重组N蛋白和阳性血清有很好的反应性,并且在血清学上有交叉反应.该研究为今后开展流行病学调查和诊断试剂的研制打下了基础.
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HCV包膜糖蛋白E2基因的克隆、蛋白表达及纯化
目的:获得大量重组HCVE2蛋白,为研究E 2蛋白的功能及制备其抗体奠定基础.方法:利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp(384-661 aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+)上,得到重组质粒pET32a-HCVE2,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和western blot检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化融合蛋白.结果:经IPTG诱导后,可见分子量约55 000的融合蛋白表达;表达的蛋白主要以包涵体形式存在;经Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化的融合蛋白与抗His抗体及HCV阳性血清具有良好的反应原性.结论:HCV E2基因的克隆、表达及其融合蛋白的纯化为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.
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屋尘螨变应原Der p5在大肠埃希菌中的表达及纯化
目的 克隆表达屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)第5组变应原Der p 5基因,在E.coli中表达、纯化重组Derp5蛋白,并分析其血清IgE反应原性.方法 以合成的Der p 5核酸序列为模板进行PCR扩增,产物经双酶切后与载体pCold-TFM连接,构建重组表达质粒pCold-TFM-Der p 5,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.用镍离子亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化目的蛋白,尘螨过敏患者血清鉴定其IgE反应原性.结果 重组表达质粒pCold-TFM-Der p 5经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的可溶性高表达,每升细菌表达产物经纯化可得到纯度95%以上的Der p 5蛋白约6 mg.纯化的重组Der p 5蛋白与尘螨过敏患者血清IgE有结合活性.结论 成功构建了Der p 5原核表达载体,高效表达并纯化了目的蛋白,纯化的重组Derp5蛋白具有良好的IgE反应原性,为屋尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及致敏蛋白的进一步研究奠定了基础.
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重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定
目的 原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析.方法 通过FCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定.结果 成功扩增到904 bp的目的 基因.重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确.SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%.Western blot分析表明目的 蛋白具有较好的反应原性.ELISA试验证实目的 蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应.结论 已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础.
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牛传染性鼻气管炎病毒gC结构蛋白的真核表达及其反应原性分析
目的 真核表达牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gC结构蛋白,并对其反应原性进行鉴定.方法 以GenBank中登录的IBRV基因序列合成gC基因全长,构建重组真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并进行双酶切鉴定.将鉴定正确的质粒转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gC蛋白,经Dot blot和间接免疫荧光法鉴定其反应原性.结果 质粒pCDNA4-gC-His经双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组gC蛋白相对分子质量约54 000,纯化后的浓度为0.03 mg/mL,可与IBRV免疫的兔多抗发生反应.结论 成功构建了真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并能在MDBK细胞系中正确表达,表达的蛋白与天然IBRV gC蛋白具有相同的反应原性,为后续免疫学诊断方法的建立奠定了基础.
关键词: 牛传染性鼻气管炎病毒 gC蛋白 真核表达 反应原性 -
国产水痘减毒活疫苗在免疫损害病人中的应用
目的 观察国产Oka株水痘减毒活疫苗在急性白血病、实体肿瘤和接受免疫抑制剂治疗的免疫损害病人中的反应原性和抗体应答.方法 国产Oka株水痘减毒活疫苗接种于3种免疫损害病人,用ELISA法检测免疫前和免疫后抗体水平,并观察副反应情况.结果 接种疫苗的3种病人均无异常反应发生,仅有少数病人在观察期内有中强程度发热,其中以实体肿瘤病人略多.3种病人接种前多数抗体阳性,经疫苗免疫后,抗体滴度均有不同程度上升,正在使用免疫抑制剂者抗体滴度上升不明显.结论 免疫损害病人接种国产水痘减毒活疫苗是安全有效的.
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羊布鲁菌膜蛋白的提取及血清抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法.方法 利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范嗣;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Western blot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较.结果 分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4 μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17 000~80 000之间;Western blot分析显示多条特异性反应条带.膜蛋白抗原的佳稀释度为1:1 280,抗体佳稀释度为1:10.所建立的ELISA方法特异性和精密性良好.ELISA检测豚鼠血清效价为1:64 000.检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%).结论 已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法.
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婴儿初免DTPa-HBV-IPV/Hib六价联合疫苗的安全性、反应原性和免疫原性
由于推荐婴儿通过主动免疫来预防的儿童疾病种类逐渐增多,使得儿童6岁前的免疫程序日益复杂,免疫针次增多.为此,比较了初免六价联合疫苗--无细胞百日咳疫苗DTP(DTPa)-乙型肝炎疫苗(HBV)-脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)/b型流感杆菌(Hib)结合疫苗(DTPa-HBV-IPV/Hib)与分开接种DTPa-IPV/Hib和HBV在婴儿中的安全性、反应原性和免疫原性.
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不同接种程序的A/C群脑膜炎球菌-白喉类毒素结合疫苗在尼日尔婴儿中的免疫原性、安全性和免疫记忆
A和C群脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合疫苗(MenD)已经在美国和尼日尔进行临床研究,此项研究是在尼日尔婴儿中进行的第2次临床试验,旨在根据血清杀菌活性(SBA)和ELISA应答来确定佳免疫程序,并评估接种者2岁时的记忆应答、疫苗对细菌在鼻咽部定植的影响及疫苗的反应原性.
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四价脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合疫苗在健康成人中的安全性、反应原性和免疫原性
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002 两种剂量的白喉破伤风类毒素疫苗用于6岁儿童加强免疫的反应原性和免疫原性比较
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004 婴儿接种MCC-TT的反应原性、免疫原性、免疫致敏及血清杀菌活性
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多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染肝癌细胞株HepG2的初步研究
前期工作中,我们针对丙型肝炎病毒(HCV)高变区(HVR1:390~411aa)设计并合成了多抗原肽(MAP)序列,并用MAP免疫家兔后获得高效价(1∶40 960)免疫血清,证实其具有良好的免疫原性和反应原性[1].
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乙型肝炎的免疫预防
文献报道[1],全球20亿人有现症或既往HBV感染标志,3.5亿人为慢性HBV感染,其中15%~25%将死于慢性肝病 (肝癌和肝硬化).1991年世界卫生组织在喀麦隆召开了"发展中国家控制乙型肝炎的国际会议"并通过了<消除乙型肝炎的雅温德宣言>,拉开了乙型肝炎疫苗纳入免疫规划的序幕.本文就近年来乙型肝炎免疫预防中的几个问题综述如下.
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猪鼻支原体vlp重复区融合蛋白的构建表达及反应原性分析
目的 猪鼻支原体(Mhr)是临床猪场常见病原菌之一,同时研究证实其与多种人类肿瘤有关.目前对Mhr的血清学检测尚无有效的方法.本研究以Mhr可变脂蛋白(vlp)家族为对象,设计vlp家族蛋白重复区片段融合蛋白,以作为检测用包被抗原使用.方法 根据大肠杆菌的密码子偏嗜性,设计并构建串联表达7种Mhr可变脂蛋白vlpA、B、C、D、E、F、G重复区片段的重组蛋白vlpA-G基因.将该基因片段装入pET-32a(+)载体中转化大肠杆菌,筛选鉴定获得阳性工程菌.IPTG诱导表达,镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白vlpA-G.Western Blot鉴定该重组蛋白与Mhr阳性血清的反应能力,并利用该重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA方法用于检测猪血清中的Mhr抗体.结果 构建表达vlpA-G重组蛋白的基因工程菌,经PCR及DNA测序正确.IPTG诱导后出现明显蛋白条带,经镍柱亲和层析纯化获得vlpA-G重组蛋白.Western Blot试验证明重组蛋白vlpA-G能够和Mhr阳性兔血清产生明显的阳性杂交带;利用重组vlpA-G为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法可成功检测Mhr阳性猪血清,证明该重组vlpA-G蛋白具有良好的反应原性.结论 本研究构建了重组蛋白vlpA-G并证实该蛋白具有良好的反应原性,可作为Mhr血清学诊断方法研究的候选抗原,同时也为Mhr重组蛋白疫苗提供可选抗原.
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屋尘螨变应原Der p9基因的克隆表达、纯化及反应原性鉴定
目的 克隆表达及纯化屋尘螨第九组变应原(Der p9)蛋白,并鉴定其反应原性.方法 提取屋尘螨总RNA,通过RT-PCR克隆Der P9基因,并连接到pET-32a表达载体上,得到的重组质粒pET-32a-Der p9转化至E.Coli BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白;通过West-ern blotting等方法检测Der p9重组蛋白的反应原性.结果Der p9基因片段大小约为850 bp,其基因片段与Gen Bank公布的Der p9基因(登录号为AAP57077.1)同源性为81.94%;重组Der p9在BL21(DE3)中可高效表达,分子质量约为47 kDa,表达后的重组蛋白主要以包涵体的形式存在.Der p9重组蛋白与屋尘螨过敏患者血清呈阳性反应,具有反应原性.结论成功克隆并表达出Der p9,通过纯化获得较强反应原性的Der p9重组蛋白,为尘螨过敏性疾病诊断及免疫治疗奠定理论基础.
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7型庚型肝炎病毒非结构蛋白NS3在大肠埃希菌中的表达、纯化及其反应原性鉴定
目的:研究在大肠埃希菌( Escherichia coli, E?coli)表达系统中表达和纯化7型庚型肝炎病毒(GB virus C genotype 7, GBV?C G 7)非结构蛋白NS3的149个氨基酸(NS3?149),并对其进行反应原性鉴定。方法将NS3?149基因克隆入原核表达载体pET?28a,并转化入BL21,利用异丙基?B?D?硫代吡喃半乳糖苷( IPTG)诱导其表达。用Ni2+柱对融合蛋白NS3?149进行纯化,后经Western 印迹检测其抗原特异性和反应原性。结果①成功构建了pET?28a?NS3?149重组质粒,该重组质粒转化入BL21后,融合蛋白NS3?149表达的佳条件为在32℃条件下, A600 nm等于0?8时,用1 mmol/L 的 IPTG 诱导6 h 后,融合蛋白表达量达到高。经过SDS?PAGE分析,融合蛋白以包涵体的形式表达,其大小约27 kD,与预期大小基本一致;②用感染GBV?C 7型的人阳性血清经Western印迹鉴定,融合蛋白NS3?149具有较好的反应原性,另外,其与GBV?C容易发生共同感染的HIV或HCV阳性血清无非特异性交叉反应,说明了融合蛋白NS3?149具有较好的特异性。结论本实验在大肠埃希菌中表达并纯化并获得具有良好反应原性的GBV?C 7型融合蛋白NS3?149,为进一步对GBV?C进行抗体检测的流行病学调查研究奠定了重要的前期工作基础。
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人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达及其反应原性分析
目的:探讨人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达及其反应原性分析.方法:以PCR法扩增VP1全长基因,并将其克隆到pFastBac1载体中,通过转化E.coli DH10Bac筛选阳性克隆,抽提重组VP1-Bacmid.以VP1-Bacmid经Cellfectin介导转染昆虫细胞Sf9,获取重组杆状病毒,扩增后感染Sf9细胞表达VP1蛋白,并以SDS-PAGE进行鉴定.以表达的重组VP1蛋白作为抗原,采用间接ELISA法检测B19病毒感染的患儿血清抗体,并与德国ELISA试剂盒检测的结果比较,分析表达产物的反应原性.结果:(1)获得含VP1全长基因的重组杆状病毒,转染Sf9细胞后能表达相对分子质量(Mr)约87 000的VP1重组蛋白.(2)以表达的重组VP1蛋白作抗原,与B19病毒感染的患儿血清的反应,平均A值为0.46,P/N值>2.1,与德国ELISA试剂盒检测的结果(平均A值为0.68)相似.结论:人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac表达系统中可成功表达,且表达产物能有效地与抗B19病毒的阳性血清反应,具有良好的反应原性.