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Tollip体外转染HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制
目的 探讨Tollip转染人肝癌细胞系HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制,为乙型肝炎的治疗寻找新的靶点.方法 含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip经EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切鉴定后,采用脂质体LipofectamineTM 2000转染HepG2215细胞,共设4个转染组:脂质体转染对照组(15μl脂质体)、空质粒转染对照组(6μg空质粒、15μl脂质体)、空质粒重组质粒共转染组(3 μg空质粒、3μg pCMV-HA-Tollip、15μl脂质体)及重组质粒转染组(6μgpCMV-HA-Tollip、15μl脂质体),转染48 h后,收集细胞,经Western blot检测AKT、p-AKT、NF-κB以及HA标签蛋白的表达；收集上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg的水平.结果 重组质粒pCMV-HA-Tollip经双酶切鉴定构建正确.空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组均有HA标签蛋白的表达,而脂质体转染对照组和空质粒转染对照组无HA标签蛋白表达；与空质粒转染对照组比较,空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组中NF-κB和p-AKT蛋白的表达明显降低(P＜0.01),而AKT蛋白的表达无明显变化(P＞0.05)；空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量明显低于空质粒转染对照组(P＜0.01),对HBsAg的抑制率分别为24％和41％,对HBeAg的抑制率分别为13％和31％.结论 pCMV-HA-Tollip重组质粒在HepG2215细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌,其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF-κB的表达有关.
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自身γδT细胞的体外培养鉴定和治疗慢性乙型肝炎的临床观察
目的 探讨采用异戊烯焦磷酸(IPP)刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)特异性扩增 r δT细胞,观察其在体外对HBV复制和HBeAg表达的影响,并评估应用rδT细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效.方法 在体外应用IPP和IL-2刺激培养人外周血PBMCs8天,采用流式细胞术检测rδT细胞百分率及细胞表面穿孔素、粒酶B、NKG2D和CD44表达量;采用ELISA法检测培养上清IFN-r、TNF-a和IL-12含量;将rδT细胞与HepG2215细胞按比例共孵育后,检测上清HBeAg和HBV DNA水平.将培养成功的rδT细胞回输治疗慢性乙型肝炎患者50例,12个月后观察疗效.结果 人外周血PBMCs在培养前rδT细胞数占5.12%,CD44表达5.13%.在培养8天后则分别升至91.27%和94.00%;rδT细胞表面穿孔素、粒酶B、NKG2D受体表达量(分别为57.1%、71.6%和71.7%)明显高于培养前(分别为0.2%、1.1%和1.3%);rδT细胞分泌IFN-r和IL-12量明显增加;扩增的rδT细胞能够抑制HepG2215细胞HBV DNA复制和HBeAg的表达;rδT细胞治疗慢性乙型肝炎患者,HBeAg转阴率为54.3%(25/46),HBV DNA转阴率为66.0%(33/50).结论 乙型肝炎患者PBMC经刺激培养获得的rδT细胞免疫功能增强,初步观察表明有一定的临床治疗作用.
关键词： 慢性乙型肝炎 rδT细胞 HepG2215细胞 免疫治疗 -
重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定
目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制.方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒.收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率.结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73 bp,与预期值一致.脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106 CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率高可达61.56%.结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据.
关键词： 核酶 包装病毒 HepG2215细胞 -
丹参多酚酸盐对HepG2215细胞X蛋白(HBx)表达的影响
目的:研究丹参多酚酸盐对HepG2215细胞X蛋白(HBx)表达的影响.方法:将HepG2215细胞分为对照组和药物组,药物组设三个浓度（100μg/ml、200μg/ml、400μg/l）.待药物作用细胞24h后,荧光定量PCR法检测HepG2215细胞HBx mR-NA表达水平,ELISA法检测细胞内HBx蛋白的表达水平.结果:与对照组相比,药物组在不同的剂量100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml下均可明显降低HBx mRNA的表达水平,但不呈现剂量-反应关系.ELISA结果显示:药物组在不同的剂量100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml下均可明显降低胞内HBx蛋白表达的水平,且呈现剂量-反应关系.结论:丹参多酚酸盐可显著影响HepG2215细胞中X蛋白的表达.
关键词： 丹参多酚酸盐 HepG2215细胞 X蛋白(HBx)
