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影响人间充质干细胞数量的因素
近年来,由于世界人口的老龄化及许多疾病的不可治愈性,成人间充质干细胞(hMSCs)用于细胞治疗越来越受到重视.虽然成人间充质干细胞可来源于骨髓、脂肪、脐血、脐带、胎盘、骨骼肌等,但由于其细胞数目较少,在临床运用之前必须依靠体外扩增来获取理想的细胞数量.本文拟搜索前期研究来探讨人间充质干细胞体外扩增期间影响细胞数目的因素,如供体的年龄、性别、组织来源选择及细胞接种密度,从而优化获取足量人间充质干细胞的过程,进而为今后临床干细胞治疗提供必要的理论基础.
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人牙髓干细胞的高效扩增及其对分化潜能的影响
目的 检测不同接种密度对人牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)增殖能力和分化潜能的影响,建立其高效扩增方法.方法 不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数,观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力.结果 低密度培养的乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth.SHED)始终保持较高增殖、克隆形成率:而低密度DPSCs只在前3代保持与常规密度相似的增殖、克隆形成效率,3代以后其增殖和分化能力明显下降.低密度培养条件下DPSCs的矿化能力与常规密度的没有明显差别.结论 1.5-3 cells/cm2低密度接种培养DPSCs有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能.SHED的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs.
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不同孔径聚乳酸-壳聚糖-明胶支架对成纤维细胞粘附效果的研究
目的:比较L929细胞在聚乳酸-壳聚糖-明胶(PLA-Chitosan-Gelatin)梯度孔径、均匀孔径两种支架材料上的细胞接种率,选择细胞接种率较高的支架材料；通过比较不同细胞密度在聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架上的细胞粘附量,探究细胞接种的适宜密度.方法:在两种孔径支架材料上分别接种不同密度的细胞悬浮液,MTT法检测其粘附情况；调整细胞接种密度到同一梯度孔径支架材料上,MTT法比较不同密度细胞在同一梯度孔径支架上的粘附情况.结果:L929细胞在两种支架上均能粘附,在聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架上的接种率明显高于均匀孔径支架(P＜0.01),且随接种密度的增高,粘附到梯度孔径支架上的细胞数量增加,当细胞接种密度达1.0×106/mL时,支架上粘附的细胞数量大.结论:聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径较均匀空径支架材料细胞接种率高,1.0×106/mL为L929细胞在梯度孔径支架上的较适接种密度.
关键词： 聚乳酸-壳聚糖-明胶 梯度孔径 支架 接种率 接种密度 -
人脐血内皮祖细胞体外扩增、鉴定和生物学活性
目的 建立一种稳定的体外分离培养和鉴定人脐血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的方法 ,并探讨利于EPCs增殖的佳接种浓度.方法 采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞,制成1×106/ml、1.5×106/ml、2 × 106/ml、2.5×106/ml、3 × 106/ml、3.5×106/ml、4×106/ml 7个密度接种于铺被人纤维连接蛋白的培养瓶,比较各接种密度的贴壁细胞数和细胞集落形成情况,并采用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和免疫荧光鉴定EPCs.结果 不同接种密度得到的贴壁细胞数和细胞集落数有差别,在2.5×106/ml密度接种时得到的佳贴壁细胞数和细胞集落数,与其他密度比较差异有统计学意义(P<0.05);双染色阳性细胞为正在分化EPCs;流式细胞仪检测内皮祖细胞对CD34、AC133、VEGFR2的阳性表达率分别为(1.67±0.35)%、(12.63±9.70)%、(66.81±6.63)%;免疫荧光检测内皮祖细胞一致性表达CD34、AC133、VEGFR2;黏附能力和迁移能力检测结果 分别为(33.7±1.6)、(29.2±1.2).结论 采用Ficoll密度梯度离心法结合贴壁筛选法可以较好地分离人脐血EPCs,以2.5×106/ml的密度接种培养可获得良好的细胞分化和增殖.
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关节软骨组织工程种子细胞的优化获取
目的优化关节软骨组织工程种子细胞的体外获取方法.方法分析不同代次体外单层培养幼兔关节软骨细胞接种密度与相对接种存活率的关系,并观察其细胞生长状况、形态特征及分化功能.结果相同培养条件下,体外单层培养关节软骨细胞的相对接种存活率和生长活性与其接种密度呈正相关;同一代次适宜密度[(2～3)×104/cm2]接种者的相对接种存活率和生长活性同高密度[(4～5)×104/cm2]接种者相近;传代培养(第2～4代)细胞的相对接种存活率和生长活性相对高于原代培养者.结论在相同培养条件下及一定传代次数内,适宜密度接种进行关节软骨细胞单层传代培养,可获取数量多、活性高的关节软骨组织工程种子细胞.
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培养条件对CD34~+细胞体外诱导分化和扩增红细胞的影响
目的 观察培养基以及细胞接种密度对体外诱导CD34~+细胞向红细胞增殖和分化的影响.方法 将脐血来源的CD34~+细胞用无血清培养基或含10%胎牛血清(FCS)的IMDM培养基培养(6孔培养板,3 mL/孔),添加的细胞因子为100 ng/ml干细胞因子(SCF)、5 ng/ml白细胞介素3(IL-3)、3 IU/ml促红细胞生成素(EPO),细胞初始接种密度为10~4/ml或10~5/ml,并通过间充质干细胞(MSC)的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化.结果 培养23 d后,无血清培养基组细胞扩增倍数达到2.54×10~5倍,其中红系细胞>95%,而IMDM/5%FCS组的大扩增倍数只有1.84×10~4倍,其中的红系细胞约占40%.培养8 d后初始接种密度为10~4/ml的CD34~+细胞增殖(420±40)倍,而10~5/ml的CD34~+细胞增殖(162±45)倍.结论 CD34~+细胞在无血清培养基中的扩增倍数以及终诱导出的红细胞,都明显高于在IMDM/10%FCS培养基中所占比例,10~4/ml的CD34~+细胞接种密度比10~5/ml更有利于细胞的扩增.
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牛肾细胞在两种不同载体中培养效果的比较
目的 通过牛肾细胞在两种不同载体中培养效果的比较,为牛肾细胞在细胞工厂中规模化生产提供真实的、有力的支持.方法 不同代次牛肾细胞在两种载体中经过相同培养条件进行培养.结果 实验中原代牛肾细胞在细胞工厂接种密度为5.5×104/cm2左右,在15 L转瓶接种密度为9.0×104/cm2左右.一代牛肾细胞在细胞工厂接种密度为6.5×104/cm2左右,在15 L转瓶接种密度为10×104/cm2左右.二代牛肾细胞在细胞工厂接种密度为7.0×104/cm2左右,在15 L转瓶接种密度为14×104/cm2左右.两种载体中牛肾细胞生长状况均能达到培养要求.结论 细胞工厂能在有限的空间内利用大限度的培养表面培养牛肾细胞,不仅节约了传代前的细胞用量,而且提高了培养后的细胞产量.
