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牛凝血酶等电点的初步测定
作为一种新型的速效局部止血药和工具酶,凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛,牛血浆是其重要的来源之一.等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤,测定其等电点后,再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品.本实验的目的是采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳的方法,结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点.经双向电泳后,SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点,分别测定它们的分子量和等电点,其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa,其等电点为5.19.
关键词： 牛凝血酶 等电点 等电聚焦 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 -
牛血凝血酶的制备工艺
目的 研究1种高纯度牛凝血酶的制备工艺.方法 采用不同终浓度的Ba2+吸附、硫酸铵分段盐析从牛血浆中提取凝血酶原,用Ca2+激活,活化的凝血酶用CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱纯化.结果 用冷冻1周血浆制备的凝血酶粗品产量、比活明显高于来自新鲜血浆的粗品;Ba2+终浓度在0.107 mol/L以上时凝血酶的产量较高;凝血酶原的佳激活条件为:Ca2+终浓度0.05 mol/L,37℃,30～60 min;CM-Sepharose Fast Flow柱制备的凝血酶比活达到2 000 U/mg以上.结论 该工艺适用于高纯度凝血酶的制备.
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牛凝血酶的制备研究
目的 从牛血浆中制备高活力及高收率的凝血酶.方法 以牛血为原料,采用柠檬酸钡吸附、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素色谱等方法制备凝血酶原,并模拟生理条件用凝血酶原活酶复合物,包括牛凝血因子Ⅴ、Ⅹa、磷脂和Ca2+对凝血酶原进行激活.结果 采用此方法制备的凝血酶的比活力为85 U/mg,收率为135 μg/mL 血浆.结论 采用此制备技术,可以大规模制备高活力及高收率的牛凝血酶.
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提高龙心素活性测定的重复性
龙心素是采用地龙为原料,用生物技术加工而成抗心脑血管疾病的药物.其质量标准(滇Q/WS1112-1995)采用龙心素溶液点样于纤维蛋白板上产生溶斑的大小测定其活性,此法重复性较差.＃1标准中方法的局限性1.1标准法中所用试剂质量标准规定,取已消毒的培养皿2只,分别加入2 mg@ml-1的纤维蛋白质溶液10ml,快速加入凝血酶溶液(每1 ml含牛凝血酶40单位)0.5ml,混匀、室温静置10 min,即成纤维蛋白板.方法中不同批号的纤维蛋白原试剂所含可凝蛋白的量不等,可凝蛋白量高的纤维蛋白原试剂制备成纤维蛋白板测试的溶斑明显小于可凝固蛋白量低的纤维蛋白原试剂制备成纤维蛋白板测试的溶斑.但不同批号纤维白原试剂含可凝蛋白不一致,以纤维蛋白原为定量依据会使制成的纤维蛋白浓度不一致而导致活性测定的重复性差.另外标准未对培养皿的尺寸作出规定,采用不同规格的培养皿也会导致测定结果的差异.
