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抑癌基因DKK2抑制儿童肾母细胞瘤细胞增殖的机制研究
目的 探讨WNT信号通路调控因子DKK2在儿童肾母细胞瘤细胞和组织中的表达,及对儿童肾母细胞瘤细胞SK-NEP-1增殖的影响,并初步探讨其作用机制.方法 通过RT-PCR、qRT-PCR和免疫蛋白印迹实验分析DKK2在儿童肾母细胞瘤细胞系和组织中的相对表达;将DKK2过表达的SK-NEP-1细胞设定为实验组(DKK2组),空白对照质粒组设定为对照组(Vector组),分别转染pcDNA3.1(+)-Flag-DKK2质粒(实验组)和pcDNA3.1(+)-Flag-Vector质粒(对照组)至SK-NEP-1细胞系,RT-PCR和免疫蛋白印迹实验验证DKK2的过表达;通过CCK-8实验和细胞克隆实验分析DKK2对细胞增殖的影响;流式细胞周期和凋亡实验验证DKK2过表达对细胞增殖的作用机制;裸鼠成瘤实验验证DKK2体外对细胞增殖的影响;通过qRT-PCR、WB及免疫组化分析DKK2对细胞增殖抑制的作用机制.结果 与正常肾上皮组织相比,DKK2 mRNA在儿童肾母细胞瘤细胞和组织中的中表达明显下调,差异具有统计学意义(P<0.001);与对照组相比(100％),转染后24、48、72 h实验组细胞活性受到明显的抑制(P<0.05),同时实验组细胞克隆形成明显受到抑制(31.11±2.14)％(P<0.05);流式细胞实验发现,与对照组相比,实验组细胞明显阻滞于G1期(P<0.001),实验组中细胞凋亡率明显升高(P<0.001);与对照组相比,过表达DKK2后裸鼠肿瘤和体积大小明显降低(P<0.001);过表达DKK2后,active-β-catenin及下游的基因受到了明显抑制.结论 DKK2在人皮肤肾母细胞瘤组织中表达下调,可能通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路参与肾母细胞瘤的机制.
关键词： 儿童肾母细胞瘤 DKK2 抑癌基因 细胞增殖 Wnt/β-catenin -
膀胱癌病灶内癌基因DKK2、SPOCK1表达量的变化及其与癌细胞增殖、侵袭的相关性
目的:研究膀胱癌病灶内癌基因Dickkopf2(DKK2)、sparc/osteonectin,cw cv and kazal-like domains proteoglycan 1(SPOCK1)表达量的变化及其与癌细胞增殖、侵袭的相关性.方法:收集我院手术切除的膀胱癌病灶及癌旁病灶,采用试剂盒测定DKK2 、SPOCK1及增殖基因、侵袭基因的mRNA表达量.结果:膀胱癌病灶内DKK2 、细胞增殖抑制基因(HSG ) 、p16 、细胞粘附分子-1 (CADM 1 ) 、金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP2)、TIMP4的mRNA表达量明显低于癌旁病灶,SPOCK1、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、c-myc、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA表达量明显高于癌旁病灶;DKK2与β-catenin、CyclinD1、c-myc、Vimentin、MMP2呈负相关,与HSG、p16、CADM1、TIMP2、TIMP4呈正相关;SPOCK1与β-catenin、CyclinD1、c-myc、Vimentin、MMP2呈正相关,与HSG、p16、CADM1、TIMP2、TIMP4呈负相关.结论:膀胱癌病灶内癌基因DKK2的低表达、SPOCK1的高表达与增殖、侵袭基因的变化有关,可能参与病灶的生长.
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miR-218调控DKK2在结核感染机制中的初步研究
目的 探讨miR-218调控DKK2参与结核感染的分子机制.方法 选择62例结核病患者(结核组)和64例健康体检者(对照组)作为研究对象,采用逆转录-荧光定量PCR检测miR-218及其靶基因DKK2的表达水平;在结核感染细胞模型中,分别在6、12、24 h检测miR-218、DKK2及肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6的表达水平.结果 与对照组比较,miR-218在结核组的表达显著下调(P＜0.05),DKK2明显上调(P＜0.05).在结核感染细胞模型中,6h时miR-218的表达显著下降而DKK2表达明显升高(P＜0.05);随时间延长两者的表达水平与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);在24 h时TNF-α表达增高(P＜0.05),IL-6出现表达下调(P＜0.05).结论 结核分枝杆菌可能通过诱导宿主miR-218表达下调,靶向抑制DKK2作用减弱,Wnt通路活性降低,进而打破免疫调节平衡促进结核病的发生.
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抑癌基因DKK2在乳腺癌细胞中的表达及作用机制
目的 研究抑癌基因DKK2在乳腺癌细胞中的表达及作用机制.方法 通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测正常乳腺组织及乳腺癌(MDA-MB-231、MCF7)细胞中DKK2基因表达情况.通过转染DKK2质粒,让两株乳腺癌细胞稳定表达DKK2后.转染前细胞做为对照组加Vector标记,转染后细胞株作为实验组加DKK2标记.进一步通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western-blot分析DKK2、Notch信号通路及其相关因子的表达.并通过细胞功能实验(克隆形成、流式细胞凋亡实验、Transwell实验)检测细胞增殖、凋亡、迁移能力.结果 DKK2在乳腺正常组织中高表达,而在乳腺癌细胞中(MDA-MB-231、MCF7)不表达.MDA-MB-231细胞转染前凋亡数为(2.57±1.18),转染后凋亡数为(49.53±8.27),转染后MDA-MB-231细胞相对转染前克隆形成率为20.44％,差异均具有统计学意义(P＜0.005).转染后的MCF7/DKK2细胞相对转染前的MCF/Vector细胞克隆形成率为15.21％,差异有统计学意义(P＜0.005).MB231/DKK2组细胞凋亡数为(49.53±8.27),MB231/Vector组细胞凋亡数为(2.57±1.18),差异具有统计学意义(P＜0.005).MB231/DKK2组迁移细胞数为(112.0±8.1),MB231/Vector组细胞迁移细胞数为(178.0±12.0),差异具有统计学意义(P＜0.005).以MB231/Vector组细胞Notch 1的mRNA表达记为1,MB231/DKK2组细胞Notch 1的mRNA表达为0.025 0,差异具有统计学意义(P＜0.01).MB231/Vector组细胞JAG1的mRNA表达记为1,MB231/DKK2组细胞JAG1的mRNA表达为0.289 1,差异具有统计学意义(P＜0.005).结论 转染不表达DKK2的这两株乳腺癌细胞株,使其过表达DKK2后可促进细胞凋亡来抑制其增殖,且细胞迁移受到抑制.说明DKK2可通过失活Notch信号通路来发挥抑癌作用.DKK2作为抑癌基因,可能成为乳腺癌早期诊断及治疗的靶基因之一.
