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细粒棘球绦虫转醛醇酶基因的克隆、表达及其潜在免疫诊断价值的研究
目的 对细粒棘球绦虫转醛醇酶(Echinococcus granulosus transaldolase,EgTAL)编码基因进行生物信息学分析、克隆和表达,并对其作为药物靶标及其潜在的免疫诊断价值进行初步评价. 方法 运用多种软件分析EgTAL的理化性质、保守功能域、同源性和三级结构等.从重组质粒pBluescriptⅡSK Egtal中PCR扩增Egtal基因,克隆至pET30a,构建表达载体pET30a-Egtal,转化大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21 (DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白EgTAL,与细粒棘球蚴病患者血清进行蛋白质印迹(Western blotting)分析.用20份已确诊的细粒棘球蚴病患者血清和20份健康者血清,ELISA法评价重组蛋白EgTAL的免疫诊断效果.分光光度法检测重组蛋白EgTAL的酶活性. 结果 Egtal基因长981 bp,编码的蛋白含326个氨基酸,理论相对分子质量(Mr)为36 332,等电点为5.11,含TAL标识序列DATTNPSLI (31～39 aa)及酶活性催化部位,EgTAL与人TAL的同源性为62％.三级结构分子建模显示,EgTAL具有A和B两条完整的蛋白链.成功构建重组质粒pET30a-Egtal.SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示,重组蛋白EgTAL在E.coli BL21 (DE3)中获得高效表达,在Mr 36 332处可见重组蛋白EgTAL条带,主要以可溶性形式存在,EgTAL可被细粒棘球蚴病患者血清识别.ELISA分析结果显示,20份细粒棘球蚴病患者血清和20份健康者血清的平均A450值分别为1.189±0.384和0.325±0.078,其中17份细粒棘球蚴病患者血清检测结果为阳性.酶活性检测结果显示,纯化后的EgTAL具有高效酶活性,60μg EgTAL加入酶促反应体系催化反应30 min后,体系的吸光度(A 340值)由1.684±0.103降至0.139±0.009. 结论 克隆了细粒棘球绦虫Egtal基因,并在E.coli BL21 (DE3)中表达出有酶催化活性和潜在免疫诊断价值的EgTAL重组蛋白.
