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美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究
目的 分离美洲钩虫(Necator americanus)Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1(NaKuI1) cDNA,并进行原核表达,研究其抑制蛋白酶的效果.方法 根据GenBank上预测的不完整的NaKuI基因序列(XM_013449790)设计引物,运用快速扩增cDNA末端技术(SMART-RACE)分别从美洲钩虫成虫cDNA中扩增NaKuI1 cDNA的5'和3'末端序列,拼接获得全长NaKuI1 cDNA.将NaKuI1成熟肽编码基因连接入原核表达载体,构建重组质粒p ET3 2a-sumo/ NaKuI1,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导NaKuI1融合蛋白表达.表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后,用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白rNaKuI1.用凝血时间法检测rNaKuI1的抗凝活性,发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用.结果 获得NaKuI1全长cDNA,其编码的多肽由84个氨基酸残基组成,其中含16个氨基酸残基组成的信号肽,68个氨基酸残基组成的成熟肽.成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体.经变性、复性后纯化的rNaKuI1无抗凝血活性.在100倍摩尔浓度比下,rNaKuI1对人纤溶酶(5 nmol/L)、人胰蛋白酶(1 nmol/L)和猪胰蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率近100％,对牛α-胰糜蛋白酶(1nmol/L)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率分别约31.45％和25.18％,对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用.rNaKuI1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数(ki)分别为(21.17±7.22)和(21.72±3.95)nmol/L.结论 成功分离获得NaKuI1全长cDNA序列,其原核表达产物rNaKuI1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点.
