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胚胎干细胞体外定向分化为Ngn3+胰岛祖细胞的基因表达谱分析
目的 探讨胚胎干细胞体外定向分化为胰岛祖细胞的基因表达谱.方法 采用逐步诱导分化方案体外传代培养胚胎干细胞,应用RT-PCR和免疫细胞化学方法鉴定各分化阶段相关特异基因的表达,应用Illumina Mouse Ref-8 vl.1小鼠基因表达谱芯片测定胚胎干细胞来源的不同阶段的分化细胞(第4、8、15、20、22和25天)与未分化胚胎干细胞的基因组表达谱.结果 本研究得到了86个阶段特异性表达基因,6组具有相同表达趋势的基因簇,6组阶段差异表达基因组.从数量上看,差异表达基因多的阶段是后前肠阶段(201个基因),接下来是定形内胚层细胞阶段(17个基因).结论 应用基因芯片对胰腺发育过程中具有相同表达趋势的基因和阶段差异表达基因的分析为早期胚胎发育和胰腺发育研究提供了试验依据.
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多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案
目的 探讨胚胎干细胞(ESCs)体外定向分化为胰岛祖细胞的分化潜能,应用多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高胚胎干细胞向胰岛祖细胞分化的效率.方法 体外传代培养ESCs,采用逐步筛选分化方案,在不同的分化阶段,给予不同的生长因子诱导分化后,RT-PCR法检测胰腺特异性基因的表达,筛选佳的诱导因子组合,并用免疫细胞化学方法鉴定相关特异蛋白的表达,从而建立体外高效的定向分化方案.结果 从未分化ESCs定向分化为定形内胚层细胞,以活化素A诱导组的Sox17和Foxa2基因表达显著;从定形内胚层细胞分化到后前肠细胞,以维甲酸+FGF10诱导组的Hnf4a和Hnf6基因表达显著;从后前肠细胞定向分化到胰腺内胚层细胞,以维甲酸+环杷明+DAPT+Exendin 4诱导组的Pdx1、Ptfla、Hblx9等胰腺特异性基因表达显著;从胰腺内胚层细胞定向分化到胰岛祖细胞,以维甲酸+DAPT+Exendin 4诱导组的Ngn3、Nkx6.1、Pax4、Pax6等基因表达显著.免疫细胞化学方法检测可见胰腺特异性的相关蛋白表达,多数Ngn3+细胞同时表达胰腺特异性基因Nkx6.1和Pdx1.结论 应用多步骤诱导逐步筛选法可以建立高效的ESCs定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高ESCs向胰腺内胚层分化的分化效率,为1型糖尿病的β细胞再生治疗提供试验依据和可行性方案.
