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沉默MDR1基因表达逆转白血病耐药HT9细胞对大蒜素的耐药性
目的:利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体沉默耐药细胞HT9中MDR1基因表达,从而逆转人早幼粒白血病细胞株HT9对大蒜素的耐药性.方法:根据MDR1基因序列设计shRNA片段,构建靶向MDR1基因的pSilencer3.1-shMDR1表达载体,稳定转染HT9细胞,real-time PCR检测细胞中MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测HT9细胞中P-糖蛋白(MDR1基因编码)的表达,MTT法检测细胞存活率,琼脂糖凝胶电泳检测经大蒜素处理后HT9细胞的凋亡,电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞术检测细胞周期.结果:成功构建靶向MDR1的表达载体pSilencer3.1-shMDR1,稳定转染HT9细胞形成HT9-shMDR1细胞系,HT9-shMDR1细胞中MDR1 mRNA表达显著降低[(0.027 ±0.002) vs (0.110±0.005),P＜0.01],P-糖蛋白表达也明显降低[(0.856 ±0.014)vs(1.454 ±0.027),P＜0.05].大蒜素对HT9-shMDR1细胞的IC50较对未转染组HT9细胞明显降低[(26.66±0.59) vs(52.75±0.64) μg/ml,P＜0.01],HT9-shMDR1细胞对大蒜素耐药的相对逆转率为(49.45±1.86)％.与未转染组HT9细胞相比,经大蒜素处理后HT9-shMDR1细胞凋亡的DNA片段更为明显,电镜下可见细胞凋亡特有的半月体形成.大蒜素处理不影响未转染组HT9细胞和对照质粒转染后HT9细胞(HT9-neo细胞)的细胞周期,但大蒜素处理使HT9-shMDR1细胞的S期细胞比例减少[(31.40±2.13)％vs(53.80±1.87)％,P＜0.01],G2/M期细胞比例增多[(35.62 ±2.06)％vs(9.37±2.09)％,P＜0.01].结论:靶向MDR1的干扰表达载体pSilencer3.1-shMDR1能够抑制MDR1基因的表达,从而逆转HT9细胞对大蒜素的耐药性.
