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奎奴普丁的合成
普那霉素Ⅰ包括主成分普那霉素ⅠA和次成分普那霉素ⅠB、普那霉素ⅠC.粗品经甲基化反应将普那霉素ⅠB转化为普那霉素ⅠA,纯化后经Mannich反应和消除反应制得5δ-亚甲基普那霉素ⅠA(3),3与(S)-3-奎宁环硫醇反应得抗感染药奎奴普丁,总收率约37％(以普那霉素ⅠA计).
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普那霉素ⅡA的制备及纯化
采用二元液相分离系统,通过对比柱色谱硅胶、聚合物微球和反相硅胶3种不同类型色谱介质的分离效果和洗脱参数,开发普那霉素IIA的制备工艺.结果显示,选用反相硅胶C18为色谱介质,洗脱剂为乙腈∶0.05％磷酸二氢钾溶液(45∶55),上样量0.8 g/100 ml,纯化所得产品纯度≥98.5％,纯化收率≥75％.
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复合诱变法选育普那霉素高产菌株
以始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)ZP2为出发菌株,经紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)复合诱变,并结合普那霉素抗性突变株的理化筛选,选育到一株高产突变菌株UN2056,其普那霉素产量达到1490 mg/L,比出发菌株提高了45.7%.传代试验表明该高产突变菌株的高产性能遗传特性稳定.高产突变株UN2056在5 L发酵罐中进行发酵试验,其平均发酵产量达到1645 mg/L,比出发菌株提高了60.8%.
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普那霉素产生菌的推理选育
根据普那霉素的生物合成途径对普那霉素产生菌始旋链霉菌进行推理选育,原始出发菌株Streptomyces pristinaespiralis ATCC25486经过12次单菌落分离,其间经历5次UV诱变并分别筛选0.1%AAr突变株、0.3%AAr突变株、0.1%VHr突变株、200u/ml KTMr突变株、0.1%DOGr突变株,获得了突变株5.p,ristinaespiralis 12-55,其生产能力较原始出发菌株S.pristinaespiralis ATCC25486提高了100倍,达到3000u/ml.传代试验表明普那霉素高产突变株S.pristinaespiralis 12-55的高产性能遗传特性稳定.
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使用均匀设计法优化普那霉素发酵培养基碳源
目的 与方法本文主要采用均匀设计方法对普那霉素培养基进行优化,分别对糊精,蔗糖,葡萄糖,可溶性淀粉和甘油等碳源进行考察,使用软件Uniform Design Version 4.00分析发酵结果并优化配方,对软件给出的优结果继续验证并优化.结果 与结论验证试验表明,含两种碳源即糊精3%葡萄糖3%的配方可使摇瓶培养的发酵单位提高48%,在两吨罐上验证该配方,连续3批进罐发酵单位提高30%.
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普那霉素产生菌的原生质体诱变育种
普那霉素产生菌始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)11-2在含0.5%甘氨酸的种子培养基中培养到对数生长期,收集菌丝体,经2mg/ml溶菌酶在30℃下作用90min可获得大量的原生质体,其再生率为5.1%.始旋链霉菌11-2原生质体经UV诱变并在含普那霉素的再生平板上筛选普那霉素抗性菌株,从中获得一高产突变株始旋链霉菌ZP-07,普那霉素产量达到1.59g/L,比出发菌株提高101.3%.
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普那霉素ⅠA纯化工艺研究
目的 开发一种普那霉素ⅠA纯化工艺.方法 使用中压层析系统,以普那霉素ⅠA收率为指标,考察反相硅胶C18的洗脱参数和上样量,并对结晶条件进行优选.结果 30μm的反相硅胶C18为佳层析介质,洗脱剂为体积分数55％的甲醇-酸水溶液,流速为1.5BV/h层析柱体积,上样量为l0mg/mL层析介质;结晶溶剂为乙酸乙酯,结晶浓度为l00～120mg/mL;按此工艺所得产品纯度大于98.5％,总收率大于70％.结论 此种普那霉素ⅠA的纯化方法简单易行,收率稳定,为其规模化生产提供了参考.
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始旋链霉菌HCCB2003-8 snaA、snaB和snaC基因的克隆、序列分析及原核表达
以始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)HCCB2003-8的染色体DNA为模板,通过优化PCR条件扩增出FMN还原酶、PⅡA合酶的基因片段.与文献报道的基因序列做同源比较,snaA和snaB碱基序列分别只有一个碱基的差异,snaC碱基序列完全匹配.将snaA、snaB和snaC的基因片段插入原核表达载体pET30a中,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后基因分别得到表达.
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补加葡萄糖对始旋链霉菌发酵生产普那霉素的影响
在摇瓶及5 L发酵罐中研究了补加葡萄糖对始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)XC 416发酵生产普那霉素的影响.摇瓶发酵结果表明,初始葡萄糖浓度以40 g/L为宜.通过在对数生长期补加20 g/L的葡萄糖可以使生物量增加23%～31%,普那霉素的产量可以提高20%～36%;在稳定期补加20 g/L的葡萄糖虽然对生物量影响不大,但能显著提高菌体合成抗生素的能力,使普那霉紊的产量提高56%～76%;而在对数生长期中后期和稳定期前期分两次各补加10 g/L的葡萄糖,则能使普那霉素的产量提高1.92倍.5L发酵罐补料分批发酵结果表明,在对数生长期和抗生素合成的初期分三次共流加36 g/L葡萄糖不仅有效地延长了抗生素的合成期,还提高了菌体合成抗生素的能力及产物得率,终使普那霉索的产量提高1.02倍.
关键词： 普那霉素 始旋链霉菌 葡萄糖 分批发酵 补料分批发酵文献标示码:A
