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H-RasV12诱导的人成纤维细胞早期衰老中自噬的调节
目的 研究癌基因H-RasV12过度表达或激活与自噬活性的关系,在人成纤维细胞中观察Ras过度表达对自噬活性的影响.方法 在BJ人成纤维细胞中转染原癌基因H-RasV12或其空载体,通过形态学、细胞生长曲线、β-半乳糖苷染色、衰老和自噬相关蛋白表达、流式细胞分析、siRNA(small interfering RNA,siRNA)抑制自噬关键基因5(ATG5),来分析Ras过度表达的细胞效应.结果 与对照细胞相比,H-RasV12过度表达的BJ细胞出现明显的早期衰老,其自噬活性受到抑制,表现为蛋白p62和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(Light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)的显著蓄积,在研究时间区间内这种抑制作用保持稳定,同时细胞凋亡率增加;利用siRNA抑制ATG5表达,抑制自噬可进一步加重衰老.结论 人成纤维细胞稳定表达癌基因H-RasV12后,可出现自噬活性受到抑制的现象,且自噬抑制处于自噬过程的后期.这一现象可能与Ras相关性癌症的癌变机制有关.
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髓核中p16INK4a的表达及其对椎间盘退变的影响
目的 探讨同一年龄段、不同程度腰椎间盘退变患者髓核中p16INK4a的表达,明确其与椎间盘退变的关系,为退变椎间盘的生物学修复提供依据.方法 收集腰椎间盘退变患者退变髓核标本17例,年龄40～50岁;退变按Pfirrmann分级为Ⅲ级10例、Ⅳ级7例.检测衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)活性,评价细胞衰老情况;免疫组织化学染色和Western blot检测聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、含血小板凝血酶敏感蛋白的解聚素与金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS 5)、Sry相关的HMG盒转录因子9(Sry-related HMG box transcription factor 9,Sox-9)、p16INK4a蛋白表达.采用Bivariate过程分析ADAMTS 5和p16INK4a蛋白表达的相关性.结果 Ⅲ、Ⅳ级髓核组织内均可见到绿染的SA-β-gal阳性髓核细胞(nucleuspulposus cells,NPCs),多呈簇状分布,其中Ⅲ级中也可见少量单个分布的绿染NPCs,呈圆形,其外周由多层细胞外基质包裹,而Ⅳ级中难以见到单个分布的绿染NPCs; Ⅲ、Ⅳ级髓核组织阳性细胞百分比分别为22.7％±5.4％和37.1％±7.6％,差异有统计学意义(t=-9.666,P=0.000).免疫组织化学染色和Western blot检测示,Ⅳ级髓核组织中p16INK4a、ADAMTS5染色阳性细胞百分比和蛋白相对表达量明显多于Ⅲ级,而Aggrecan、Sox-9明显少于Ⅲ级,差异均有统计学意义(P＜0.05).退变髓核组织中ADAMTS 5与p16INK4a的蛋白表达成线性相关(r=0.908,P=0.000).结论 过早衰老NPCs的累积与椎间盘退变程度密切相关,p16INK4a参与的NPCs过早衰老对椎间盘退变进程起着主导作用.
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过早衰老髓核细胞微环境中BMSCs的生物学行为研究
目的 探讨在过早衰老髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)微环境中BMSCs的生物学行为,为充分利用BMSCs干细胞特性进行退变椎间盘修复奠定实验基础. 方法 收集人退变髓核组织与正常骨髓组织进行NPCs、BMSCs分离、培养及鉴定;对过早衰老诱导的第1代NPCs和正常第3代BMSCs行非接触共培养,根据NPCs与BMSCs不同比例将实验分为A组(75％∶25％)、B组(50％∶50％)和C组(0∶100％).倒置相差显微镜和透射电镜观察各组BMSCs形态变化;对培养3、6d的BMSCs进行增殖能力检测:细胞计数试剂盒8检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞周期、BrdU标记流式检测DNA代谢;培养6d检测衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)活性评价细胞衰老. 结果 倒置相差显微镜示A、B组BMSCs中混杂的三角形或大多角形细胞增多,尤其是A组;透射电镜观察A、B组均可见典型衰老形态的细胞.培养3、6d,A组细胞存活率均显著低于B组,差异有统计学意义(P＜0.05).3d时,A组G1期细胞比例明显高于B、C组(P＜0.05),S期细胞比例明显低于B、C组(P＜0.05).6d时,A组约81.0％细胞停滞于G1期,S期及G2期细胞比例减小,与B、C组比较各细胞周期分布差异均有统计学意义(P＜0.05);B组细胞停滞于G1期比例增加至约74.4％,与C组比较各细胞周期分布差异均有统计学意义(P＜0.05).培养3、6d,A组掺入的BrdU含量均明显低于B、C组(P＜0.05);B、C组间3d时差异无统计学意义(P＞0.05),6d时B组明显低于C组(P＜ 0.05).培养6d,A、B组SA-β-gal活性显著提高,3组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 过早衰老的NPCs可通过旁分泌效应下调共培养的BMSCs增殖能力,而NPCs数量上的优势使得共培养的BMSCs更早表现出衰老特征.
