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Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型的建立及表型分析
目的 建立Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型并开展相关表型分析,以满足我国糖尿病相关研究和药物研发的需求.方法 通过基因工程技术建立Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型,测定三种基因型小鼠体质量、血糖变化;分别取三种基因型8月龄小鼠,检测血糖、血清胰岛素,以及肝功能、肾功能、血脂等血液生化指标,进行统计分析;对纯合子和野生型小鼠的肝脏、肾脏进行病理分析.结果 成功获得Leprtm1Srcmo基因敲入小鼠模型;初步表型分析显示:Leprtm1Srcmo基因敲入纯合子小鼠出生4周起即表现出过度肥胖,纯合子雄鼠表现出高血糖、高胰岛素、脂质代谢紊乱、肝肾功能异常等表型,13月龄Leprtm1Srcmo小鼠血糖恢复正常;病理检测发现,Leprtm1Srcmo小鼠肝肿大,并出现肝细胞空泡化等脂肪变性现象,以及肾小球肥大等病理改变.结论 该模型的建立为进一步研究2型糖尿病发病机制及治疗方法奠定了基础.
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DSG2F536C点突变基因敲入小鼠心脏表型的观察研究
目的 观察桥粒芯糖蛋白2(DSG2)点突变(DSG2F536C)基因敲入小鼠心脏结构、功能、病理学改变,并初步探讨其纤维化的发生机制.方法 构建DSG2F536C 突变基因敲入小鼠模型,分为纯合子突变组(DSG2mt/mt)、杂合子突变组(DSG2mt/wt)和野生型组(DSG2wt/wt).分别行超声心动图检查小鼠心脏结构和功能,Masson三色染色和HE染色观察心肌组织病理特点,并用Western blot法测定心肌组织转化生长因子-β1(TGF-β1)的蛋白表达.结果 与DSG2wt/wt组小鼠相比,DSG2mt/wt组小鼠左室射血分数和缩短分数显著降低,DSG2mt/mt组小鼠则较DSG2mt/wt组进一步降低,并伴有室壁明显变薄和心腔显著扩大.DSG2mt/mt组小鼠的右心室出现心肌排列紊乱、纤维化和炎性反应,约1/3的小鼠同时累及左心室,而DSG2mt/wt组小鼠仅见心肌排列紊乱.与DSG2wt/wt组小鼠相比,DSG2mt/wt组和DSG2mt/mt组小鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达明显升高.结论 DSG2F536C小鼠表现出心室扩大、室壁变薄、心功能下降、炎性反应和心室纤维化浸润和TGF-β1升高等表征,类似于临床致心律失常性右室心肌病(ARVC)患者的表型,提示其为致病性突变.此外,DSG2F536C基因敲入小鼠为深入研究DSG2突变导致ARVC的发病机制提供了良好的动物模型.
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异丙酚诱导GAD67-GFP基因敲入小鼠意识消失过程中GABA能神经元的活化
探讨在系统性给予谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠异丙酚后诱导的意识消失作用中的GA-BA能神经元的活化情况.GAD67-GFP阳性小鼠20只,腹腔注射异丙酚130 mg/kg(对照组腹腔注射相同体积的生理盐水).分别在注射后5 min,30 min,1 h进行行为学评分,随后立即处死并取脑,应用免疫组织化学观察神经元活化标记物Fos在全脑的表达分布并用免疫荧光双标的方法观察Fos与GABA能神经元的共存情况.行为学结果表明在给予异丙酚后5 min和30 min均能达到适度或深度麻醉效果,而1h时则处于过渡状态,行为学评分为5 min时13分,30 min时14分,1 h时为9分.与对照组相比,Fos在海马CAI区、杏仁核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、梨状核、下丘脑腹内侧核、中脑导水管周围灰质的表达在三个时间点都有明显增加(P＜0.05),在嗅球外丛状层有表达但与对照组相比无明显差异(P＞0.05).注射后5 min、30 min和1 h下丘脑腹内侧核有Fos与GABA共存,有共存的细胞占该区域Fos阳性神经元的80.3%、89.7%和91.6%.下丘脑腹内侧核GABA能神经元活化是异丙酚诱导意识消失的可能机制之一.
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刺激延髓背角诱发的小鼠脑干网状结构内向Vmo投射的GABA能神经元突触后反应的电生理学研究
本实验利用谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲人小鼠制备离体脑片,结合TMR逆行束路追踪技术,在荧光镜和红外镜头下,利用膜片钳伞细胞记录的方法对电刺激延髓背角(即三叉神经脊束核尾侧亚核,Vc)诱发的小鼠小细胞网状结构(PCRt)内GABA能和TMR逆标的运动的神经元的突触后反应及其反应类型、药理学特征进行系统的研究.结果显示:(1)高频刺激(20 Hz)Vc,在PCRt内GFP和TMR双标的运动前神经元上可记录纠兴奋性的突触后电流(EPSCs),波形显示为单突触反应;(2)电压钳记录模式下,α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体(AMPA受体)拮抗剂氨基-2-硝基喹啉-2,3-二酮(CNQX)及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)阻断剂D,L-2-氨基-5-磷酸基戊酸(AP-5)均可显著降低刺激Vc所诱发的小鼠PCRt内GFP和TMR双标神经元的EPCSs的幅值;(3)电流钳模式下,刺激Vc,在PCRt内GFP和TMR舣标的神经元上记录到兴奋性突触后电位,其幅度与刺激强度在一定范嗣内呈正相关.以上结果提示,小鼠PCRt内向三叉神经运动核(Vmo)发出投射的GABA能运动前神经元可通过其细胞膜上AMPA受体或NMDA受体的介导,对口面部伤害性信息发挥整合和调控作用,以实现对口面部伤害性反射活动的精确调节.
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GAD67-GFP基因敲入小鼠5-羟色胺样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系
本研究应用免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉神经中脑核(Vme)内5-HT样和P物质(substance P,SP)样阳性终末分别与小白蛋白(parvalbumin,PV)样和GFP阳性神经元之间的联系.结果显示:(1)Vine内有较多的PV样阳性神经元,这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元,直径约为18～40 μm;也可观察到少量的GFP阳性神经元,多为小的多极神经元,直径约为8～15 μm;(2)5-HT样阳性终末广泛分布于Vme内,其中有部分阳性终末分别聚集在PV样或GFP阳性的Vme神经元的胞体周围,计数结果表明:大约有77.7%和22.3%的5-HT样阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触;(3)SP样阳性终未也广泛分布于Vme内,并分别与PV样或GFP阳性神经元的胞体形成密切接触,其巾有78.2%和21.8%的阳性终末分别与PV样或GFP阳性胞体相接触.以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,5-HT能和SP能神经终末小仅对初级传入发挥直接的调控作用,还可能通过影响Vme内的GABA能神经元的活动,从而间接对该信息的传递发挥调控作用.
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GAD67-GFP基因敲入小鼠三叉上核内向三叉神经运动核投射的GFP阳性神经元表达c-fos的研究
本文综合应用逆行束路追踪(将四甲基罗达明-TMR注入一侧三叉神经运动核)和免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下对谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠在口周部给予伤害性刺激时,三叉上核(Vsup)内向对侧三叉神经运动核(Vmo)投射的呈GFP阳性的GABA能神经元表达c-fos的情况进行了研究.结果显示:(1)Vsup内可观察到许多GFP阳性神经元,细胞较小;(2)也可观察到许多TMR或c-fos单标神经元较密集地分布于Vsup内,其中c-fos阳性产物只见于神经元的胞核,在胞浆内未见表达;(3)在激光共聚焦显微镜下可进一步观察到部分神经元同时呈GFP/TMR、TMR/c-fos、GFP/c-fos双重标记或GFP/TMR/c-fos三重标记.其中GFP/TMR双标神经元分别占GFP或TMR阳性神经元的17.8%和19.2%;TMR/c-fos双标神经元分别占TMR或c-fos阳性神经元的34.9%和31.3%;GFP/c-fos双标神经元分别占GFP或c-fos阳性神经元的21.2%和20.5%;而GFP/TMR/c-fos 三标神经元分别占GFP、TMR或c-fos阳性神经元的11.1%、12%和10.8%.以上结果表明小鼠Vsup内部分GABA能神经元可接受来自同侧的口面部伤害性信息,并对这些信息进行整合后,直接发出投射纤维至Vmo;故Vsup内部分GABA能运动前神经元可能参与口面部伤害性反射局部环路的构成.
