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超高效液相色谱-荧光法文献资料
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超高效液相色谱-荧光法检测精液中DNA甲基化水平
目的 建立超高效液相色谱-荧光法(UPLC-FLD)定量分析精液标本中DNA甲基化水平.方法 精液样本DNA提取、水解后,以100 mmol/L 2-溴苯乙酮为衍生试剂,在0.51 mol/L乙酸乙腈溶液中80℃加热60 min,生成脱氧胞嘧啶核苷(dC)和5-甲基脱氧胞嘧啶核苷(5mdC)的荧光衍生物(λex=306 nm,λem=378 nm).取1μL上清液进样,经Agilent C18色谱柱(2.1×100 mm、1.8μm)分离[流动相为28％甲醇+10％乙腈+62％水溶液(含0.1％甲酸),柱温40℃,流速0.3 mL/min]及统计学分析,并用临床样本进行验证.结果 在上述佳衍生反应与色谱分离条件下,7 min即可将精液DNA中的dC与5mdC完全分离,无需消除RNA干扰;本法中5mdC的检测限为2.5 pg/μL,线性范围为0.025 ～0.75 ng/μL,r ＞0.99,日间、日内变异系数(CV)＜5.6％,衍生化合物室温条件放置30 h内比较稳定.临床精液样本结果表明,少弱畸精子症患者的DNA甲基化水平低于健康男性.结论 建立的UPLC-FLD法可快速、简便、准确、稳定地检测基因组DNA甲基化水平.
关键词： DNA甲基化 精液 衍生化 超高效液相色谱-荧光法
