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LYRM1基因过表达对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响
目的 观察LYRM1基因过表达对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,分别构建YRM1基因过表达细胞株(LYRM1-pcDNA3.1/myc-His B)和空载对照细胞株(pcDNA3.1/myc-His B)；实时定量RT-PCR验证转染情况；RT-PCR检测诱导分化成熟后的线粒体代谢酶HKI,ACC,CS,CPT1和Cyc-C基因表达水平.结果 RT-PCR结果证实LYRM1质粒转染成功；与空载对照组比较,LYRMl过表达组HKI,ACC,CS,CPT1和Cyc-C mRNA表达水平均显著降低(P均＜0.05).结论 LYRM1基因过表达下调了3T3-L1脂肪细胞中线粒体的代谢关键酶基因表达水平,可能参与调节脂肪细胞线粒体的代谢.
关键词： LYRM1基因 3T3-L1脂肪细胞 线粒体代谢酶 -
LYRM1基因过表达对P19细胞凋亡的影响
目的 观察LYRM1基因过表达对P19细胞凋亡的影响.方法 将人LYRM1基因的真核表达载体(pcDNATM 3.1/myc-HisB-LYRM1)和空载体pcDNATM 3.1/myc-HisB,分别转染P19细胞,通过G418筛选2周,建立稳定过表达人LLYPM1基因的P19细胞系.用Western blot技术验证稳定表达细胞株.将稳定转染pcDNATM3.1/myc-HisB-LYRM1载体质粒和空载质粒的P19细胞以无血清培养基37℃孵育24 h以诱导细胞凋亡,收获细胞用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 建立了稳定转染LYRM1的P19细胞系,成功地表达了目的 基因.流式细胞术检测结果发现过表达LYRM1基因的P19细胞凋亡率显著降低.结论 LYRM1基因具有抑制P19细胞凋亡的作用.
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LYRM1基因沉默对成熟脂肪细胞线粒体形态及其相关基因的影响
目的 探讨LYRM1基因沉默对成熟脂肪细胞线粒体形态及相关基因的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为工具细胞,建立LYRM1基因沉默细胞株,以转染空载质粒的3T3-L1脂肪细胞作为阴性对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,采用油红O染色观察脂肪细胞分化状态,采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn) 1/2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA、线粒体分裂基因(Fis)l mRNA的表达水平.结果 1.油红O染色诱导分化第8天的脂肪细胞,发现85％以上脂肪细胞已分化为成熟脂肪细胞,细胞形态大而圆,胞质含大量被油红O染成亮红色的脂滴,比较发现2组细胞无论脂滴的大小、数量均无显著差异.2.透射电镜观察发现2组细胞的线粒体形态基本正常,线粒体无明显肿胀、皱缩,线粒体嵴清晰可见,2组细胞间线粒体数目无明显差异.3.LYRM1基因沉默成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA表达水平显著高于对照组成熟脂肪细胞.4.LYRM1基因沉默成熟脂肪细胞的Mfnl mRNA、Drpl mRNA和Fisl mRNA表达水平与对照组成熟脂肪细胞的表达水平无明显差异.结论 LYRM1基因沉默能够引起成熟脂肪细胞Mfn2 mRNA表达水平升高,对线粒体形态结构并无显著影响,提示LYRM1基因沉默可部分影响成熟脂肪细胞线粒体形态相关基因.
关键词： LYRM1基因 线粒体 3T3-L1脂肪细胞 线粒体融合蛋白 -
LYRM1基因过表达对大鼠骨骼肌细胞线粒体功能的影响
目的 评价LYRM1基因过表达对成熟骨骼肌细胞线粒体功能的影响.方法 体外培养大鼠骨骼肌细胞株(L6),分别将pcDNA3.1及LYRM1-pcDNA3.1转染L6,通过C418筛选稳定表达株,应用Western blot技术验证其转染情况.诱导L6分化成熟后电镜观察线粒体形态;经Mitotracker red染色,应用流式细胞仪检测线粒体膜电位变化.结果 Western blot技术证实LYRMl表达质粒转染成功;LYRM1-peDNA3.1组细胞线粒体凝集、形态扭曲变形及线粒体空泡化、线粒体嵴排列不规则,甚至断裂、溶解、消失;流式细胞仪检测结果显示LYRM1-pcDNA3.1组荧光值为3.7667±0.100 7,pcDNA3.1组荧光值为8.7633±0.2286,二组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 LYRM1基因在骨骼肌细胞中过表达能明显改变线粒体形态,降低骨骼肌细胞线粒体的膜电位.提示LYRM1基因在骨骼肌细胞中过表达影响了线粒体的功能.
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人类肥胖相关新基因LYRM1的克隆及其生物信息学分析
目的 克隆人类肥胖相关新基因LYRM1,并对其进行初步的牛物信息学分析.方法 以人网膜脂肪组织为模板,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,并将其克隆到TA克隆载体,RT-PCR法鉴定并测序.利用一系列牛物信息学软件或数据库初步分析预测LYRM1基因及其编码蛋白的基因结构、染色体定位、蛋白质理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、可溶性、结构域及亚细胞定位等.结果 扩增出包含LYRMI基因开放阅读框的cDNA片段,采用RT-PCR及测序方法证实成功克隆出目的 片段.生物信息学分析显示,LYRM1基因cDNA全长1 589 bp,开放阅读框长369 bp,编码122个氨基酸,相对分子质量13 270;定位于染色体16p11.2区域,含4个外显子和3个内含子.蛋白序列分析显示LYRM1基因编码蛋白无跨膜螺旋结构,为一非分泌蛋白.亚细胞定位分析提示其定位于胞核的可能性较大,蛋白结构域分析提示N端存在-LYR结构域,可能参与线粒体功能及能量代谢.蛋白序列比对提示LYRM1基因编码蛋白相对保守.结论 LYRM1基因的成功克隆及生物信息学分析为进一步研究该基凶奠定了基础.实用儿科临床杂志,2009,24(19):1470-1473
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LYRM1基因过表达对骨骼肌细胞活性氧的影响
目的 探讨LYRM1基因过表达对骨骼肌细胞活性氧簇(ROS)生成的影响.方法 培养大鼠骨骼肌细胞株(L6),分别以pcDNA3.1及LYRM1-pcDNA3.1转染L6,构建空载对照细胞株(空载对照组)及过表达LYRM1基因细胞株(LYRM1基因过表达组),筛选、验证细胞株LYRM1的表达.诱导L6分化成熟后以H2-DCFDA探针孵育,荧光显微镜下观察ROS的荧光强度,流式细胞仪定量测定ROS的生成变化.结果 LYRM1基因过表达组荧光强度明显强于空载对照组；LYRM1基因过表达组荧光值为24.8933±4.4574,空载对照组荧光值为13.1512 ±0.7347,2组比较差异有统计学意义(t=24.12,P=0.00).结论 LYRM1基因在骨骼肌细胞中过表达可显著增加其ROS的产生,提示LYRM1基因过表达可影响细胞线粒体功能,造成线粒体损伤.
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人类肥胖相关新基因LYRM1原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的 构建人类肥胖相关新基因LYRM1原核表达载体,并获取LYRM1重组蛋白.方法 采用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中扩增出LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代板乳糖苷(IPTG)诱导LYRM1融合蛋白的表达,利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)鉴定其表达.结果 PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.LYRM1基因在原核细胞中成功表达,经SDS-PAGE鉴定融合蛋白相对分子质量约为40 000,主要以不可溶的包涵体形式存在于菌体沉淀中,Western blot分析表明融合蛋白具有免疫原性.结论 成功扩增和克隆了人类肥胖相关新基因LYRM1,并通过构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
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LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达
[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.
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人类肥胖相关新基因LYRMl在人前体脂肪细胞分化过程中的表达变化
[目的] 观察LYRM1基因在人前体脂肪细胞分化过程中表达水平的变化. [方法] 体外培养人前体脂肪细胞,采用RT-PCR及Western-Blot技术检测LYRM1基因在人前体脂肪细胞分化不同阶段(前体脂肪细胞;0、2、6、12 d)核酸及蛋白水平的表达变化. [结果] LYRM1基因在分化第2 d(Day2)时核酸及蛋白表达水平均明显上调,与各时段的表达水平差异有显著性(P<0.01),其余各组之间差异无显著性(P>0.05). [结论] 初步揭示了LYRM1基因在人前体脂肪细胞分化过程中的表达变化趋势.
