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C3aR——检测肾组织肥大细胞的敏感标志
目的:探讨过敏毒素受体C3aR高表达细胞在正常个体和各种肾脏病患者肾组织中的分布情况,对其细胞类型进行鉴定,并对C3aR能否作为肥大细胞特异性标记分子进行评估.方法:利用免疫组化的方法分析C3aR高表达细胞在正常供肾组织和包括2t糖尿病肾病(T2DN)、IgA肾病、急性间质性肾炎、慢性间质性肾炎、ANCA相关性血管炎、微小病变性肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)以及狼疮性肾炎在内的各种肾脏病患者肾组织中的分布情况;利用光镜、免疫电镜、免疫荧光双套色染色和甲苯胺蓝特殊染色等方法对肾组织中高表达C3aR的细胞类型进行鉴定;在此基础上,对C3aR作为肾组织肥大细胞特异性标记分子进行评估.结果:(1)C3aR高表达细胞在正常供肾组织和包括T2DN、IgA肾病、急性间质性肾炎、慢性间质性肾炎、ANCA相关性血管炎、微小病变性肾病、膜性肾病、FSGS以及狼疮性肾炎在内的各种肾脏病患者肾组织中均存在.(2)光镜和免疫电镜的形态学分析显示肾组织中高表达C3aR的浸润细胞在形态上具有肥大细胞的特点;免疫荧光双套色染色的分析显示,这种细胞CD45阴性、CD68和类胰蛋白阳性,与肥大细胞的情况一致;甲苯胺蓝特殊染色进一步证实其为肥大细胞.(3)虽然C3aR也同时表达于小管上皮细胞等其他细胞,但其在肥大细胞中的表达水平远远高于其他细胞,这种表达水平差异足以区分肥大细胞与其他细胞.(4)与目前常用的肥大细胞标记分子--肥大细胞类胰蛋白酶相比,C3aR作为肥大细胞的标记分子具有相似的检测灵敏度和更好的特异度.结论:C3aR在肾组织肥大细胞特异性地高表达,是肾组织肥大细胞的一个敏感标记分子,完全可代替类胰蛋白酶,以免疫组化的方法检测肾组织中的肥大细胞.
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IgA肾病患者肾组织肥大细胞的分布及意义
目的:了解不同亚型IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)患者肾组织中肥大细胞的分布及其与各种疾病指标的相关性,全面探讨肥大细胞在IgAN中的可能病理意义.方法:选取包括大量蛋白尿型、反复发作肉眼血尿型、高血压型、无症状尿检异常型、血管炎型在内的IgAN患者共110例,根据肾组织肥大细胞特异性高表达C3aR的特点,利用免疫组化的方法对所有患者的肾穿刺活检标本切片进行C3aR免疫组化染色,计数各切片C3aR强阳性细胞数,同时测量切片面积,计算各患者肾组织肥大细胞分布密度(同时选取正常供肾15例作为对照);在此基础上,利用统计学方法,进行肾组织肥大细胞密度与包括血、尿生化指标,肾小管间质相对面积和肾组织炎症细胞密度在内的各种病理指标进行相关性分析,探讨肥大细胞在IgAN中的病理意义.结果:(1)肥大细胞广泛存在于各亚型IgAN患者肾组织中;与正常对照相比,各亚型IgAN患者肾组织中的肥大细胞数均有明显的增加.(2)总的来看,肾组织中肥大细胞数与血肌酐和血Cystatin C水平、尿视黄醇结合蛋白(RBP)和尿溶菌酶水平及间质炎症细胞数量,肾小管间质相对面积具显著相关性,而与尿C3、尿a2巨球蛋白(a2-MG)和24h尿蛋白水平及尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平则无明显相关性.(3)不同亚型IgAN肾组织肥大细胞与各种病理指标的相关性有明显差异,其中,反复发作肉眼血尿型与其他亚型的差异性明显.结论:肥大细胞很可能参与了包括大量蛋白尿型、反复发作肉眼血尿型、无症状尿检异常型、高血压型和血管炎型在内的各种亚型IgAN的病理过程.肥大细胞在不同亚型IgAN中的地位和作用机制也可能存在差异.
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低表达 C3aR 人肾足细胞的构建及鉴定
目的：前期的研究中发现过敏性毒素C3a受体（ C3aR）在糖尿病肾病病中表达增加，但在糖尿病肾中的病理意义及其在肾组织足细胞中的生理作用尚不清楚，文中通过建立C3aR低表达的肾足细胞系（HPC-C3aRsiRNA），为研究C3aR在肾足细胞中的生理功能提供细胞模型。方法设计合成人C3aR小干扰RNA（ C3aRsiRNA），将其克隆到慢病毒表达载体中，通过与包装质粒共转染293T 细胞，包装成 C3aRsiRNA 慢病毒，利用 C3aRsiRNA 慢病毒感染人肾足细胞 HPC，根据C3aRsiRNA慢病毒具有嘌呤霉素抗性基因的特点筛选稳定转染的人肾足细胞。通过荧光定量PCR分析稳定转染的足细胞C3aR的mRNA表达水平，Western blot和免疫组化染色分析稳定转染的肾足细胞C3aR蛋白水平，鉴定稳定转染C3aR低表达的肾足细胞系。结果荧光定量PCR结果显示，与HPC-C3aRsiRNA细胞C3aR的mRNA水平（0．26±0．04）比较，非转染HPC细胞（1．00±0．13）和阴性对照（1．07±0．16）显著升高（P＜0．05）。免疫组化染色显示HPC-C3aRsiRNA细胞的C3aR蛋白水平显著降低。 Western blot结果显示，与HPC-C3aRsiRNA C3aR蛋白表达（0．62±0．09）比较，正常HPC、阴性转染的HPC表达（1．00±0．08、1．00±0．22）显著升高（P＜0．05）。结论成功构建了C3aR低表达的肾足细胞系，可为进一步了解C3aR在肾中的生理作用提供细胞模型。
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C3a分泌性表达载体及过表达C3a肾小管上皮细胞株的构建
目的：已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在C3a／C3aR轴过度活化现象，但有关C3 a／C3 aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达C3 a的肾小肾小管上皮细胞株，为探讨各种病理情况下C3a／C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3a 分泌性表达单元，将其克隆到慢病毒表达载体pLenti6．3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点，构建成C3a分泌性表达载体pLenti6．3-C3a-IRES2-EGFP；将pLenti6．3-C3a-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞，包装成C3a表达重组慢病毒LV-C3a；以LV-C3a感染人肾小管上皮细胞系HK2，根据LV-C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点，以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆；利用荧光定量PCR和ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析，从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株。结果①成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体pLenti6．3-C3a-IRES2-EGFP；②成功进行了重组慢病毒包装，得到了高滴度（5×108个／mL）的C3a表达重组慢病毒LV-C3a；③成功进行了LV-C3a对HK2细胞的转染，得到了稳定转染LV-C3a的HK2细胞株；基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实，与HK2细胞比较，HK2-C3a细胞株中C3a mRNA表达水平显著升高[（1．0±0．5） vs （1321．0±18．0）， P＜0．01]，分泌的C3a水平显著升高[（0．3±0．2）ng／mL vs （249．0±37．0） ng／mL， P＜0．01]。结论成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研究各种病理情景中C3a／C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型，也为进一步开展C3a／C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。
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C3aR 慢病毒表达载体的构建及在肾小管上皮细胞中的转染实验
目的：前期研究发现C3aR在糖尿病肾病肾小管上皮细胞中表达上调，但其在糖尿病肾病中的病理意义未知，且有关肾组织C3aR的确切生理和病理意义亦仍不清楚。文中通过构建C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的肾小管上皮细胞株，为探讨C3aR在肾组织小管上皮细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法根据人C3aR mRNA序列合成人C3aR基因，将其克隆到慢病毒表达载体pLenti6．3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点，构建成C3aR慢病毒表达载体pLen -ti6．3-C3aR-IRES2-EGFP；经测序验证正确后，用构建的慢病毒表达载体pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞，包装成C3aR表达重组慢病毒；以C3aR表达重组慢病毒感染人肾小管上皮细胞系HK2，经药物筛选得到杀稻瘟菌素抗性细胞克隆；经荧光定量PCR分析和细胞免疫化学分析，鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株。结果①对构建成的C3aR慢病毒表达载体pLenti6．3-C3aR-IRES2-EGFP进行全序列测序验证显示序列完全正确。②以构建的C3aR慢病毒表达载体和包装质粒（pLP1、pLP2和 pLP／VSVG）共转染293T细胞，48 h后收集细胞培养上清，得到了滴度约为5×108个／mL的慢病毒液。③成功进行了C3aR重组慢病毒对HK2细胞的转染，得到了稳定转染了C3aR重组慢病毒的HK2细胞株HK2-C3aR；基于荧光定量PCR和细胞免疫化学染色的分析证实HK2-C3aR细胞株中C3aR表达水平较HK2非转染对照细胞高（2．33±0．45 vs 1．00±0．09， P＜0．05）。结论成功构建了C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株，为进一步研究C3aR过表达在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型，也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。
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糖尿病肾病患者肾脏组织中C3aR、C5aR的表达
目的：探讨C3aR、C5aR在糖尿病肾病（DN）患者肾脏组织中的表达情况及其在DN发病中的作用。方法：选取DN患者的肾脏组织标本45例作为病例组，其中肾脏病理分级为Ⅰ＋Ⅱ级13例、Ⅲ级21例、Ⅳ级11例；同时选取肾脏肿瘤患者手术切除的正常肾脏组织标本10例作为对照组。常规方法检测24 h尿蛋白定量、红细胞沉降率（ESR）、血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、C-反应蛋白（CRP）等指标。采用免疫组化方法检测C3aR、C5aR在各组肾脏组织中的表达。分析DN患者肾脏病理损伤级别与临床指标、肾组织中C3aR和C5aR阳性细胞百分比与临床指标的相关性。结果：C3aR和C5aR在各级DN患者肾脏组织中的表达均高于对照组，且随着DN肾脏病理损伤的加重，其表达逐渐增强（F＝45．987，40．426，P均＜0．001）。 DN患者肾脏病理损伤级别与24 h尿蛋白定量、Scr、BUN、CRP等呈正相关（rS 分别为0．529、0．595、0．516和0．425，P均＜0．05）；C3aR在肾脏组织中的阳性细胞百分比与24 h尿蛋白定量、Scr、BUN、CRP及ESR呈正相关（rS 分别为0．342、0．613、0．489、0．315和0．321，P均＜0．05）。 C5aR在肾脏组织中的阳性细胞百分比也与以上指标呈正相关（ rS 分别为0．403、0．441、0．315、0．456和0．389，P均＜0．05）。结论：C3aR、C5aR参与DN的发生与发展，在DN的病理损伤过程中起重要作用。
