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干扰PRMT5表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定
目的 探讨干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定.方法 针对PRMT5设计出该基因的有效短发夹RNA(shRNA)片段,选择合适慢病毒载体,通过基因工程技术,构建出PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体,并通过PCR以及测序检测构建序列的正确性.将重组病毒载体在病毒包装细胞中大量生产后,用病毒原液感染PRMT5表达量相对较高的SMMC-7721、BEL-7402细胞,2d后,用低杀死浓度的嘌呤霉素进行筛选,得到克隆样生长的细胞,扩大培养后分别提取蛋白和RNA,Western印迹和qPCR检测PRMT5的表达.结果 成功构建出由人源性PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体pLKO.1-sh-PRMT5,PCR及测序均证明构建序列的正确.Western印迹法和qPCR检测,pLKO.1-sh-PRMT5干扰组的PRMT5蛋白及mRNA水平明显低于pLKO.1-sh-GFP组(P＜0.05),pLKO.1-sh-PRMT5载体具有良好的干扰效果.结论 运用慢病毒感染并筛选出稳转细胞株,在干扰效率及经济角度均优越于瞬时转染,为今后研究PRMT5在肝癌细胞中作用功能提供了良好的科研工具.
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PRMT2真核表达载体构建及在乳腺癌MCF7细胞的亚细胞定位
目的 构建携带人蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)基因的真核表达载体pEGFP-N1-PRMT2,观察其转染乳腺癌MCF7细胞后融合蛋白在细胞中的亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因在乳腺癌中的作用奠定实验基础.方法 以本实验室保存的pGEM-T-PRMT2载体为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增PRMT2基因片段,将扩增片段经HindⅢ和Sal Ⅰ双酶切后克隆到pEGFP-N1载体,酶切与测序鉴定阳性克隆；激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在乳腺癌MCF7细胞中的定位.结果 成功构建了pEGFP-N1-PRMT2重组真核表达载体,融合蛋白主要聚集成颗粒状分布于除核仁以外的核浆中,胞质中少量弥散分布.结论 pEGFP-N1-PRMT2重组真核表达载体的构建为进一步研究PRMT2基因在乳腺癌及其内分泌治疗中的作用奠定实验基础.
关键词： 乳腺癌 蛋白质精氨酸N-甲基转移酶 真核表达载体 亚细胞定位
