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依维莫司与顺铂协同损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞机制的初步研究
目的 探讨依维莫司与顺铂联合损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的分子机制.方法 依维莫司处理细胞后的信号通路实验分为对照组、50、100、200 nmol/L依维莫司处理组4组.依维莫司与顺铂联合处理的机制实验分为对照组、50 nmol/L依维莫司、25 μmol/L顺铂、50 nmol/L依维莫司+ 25 μmol/L顺铂处理细胞组4组.通过Western印迹进行mTOR、Akt、DNA损伤相关信号以及Chk通路分析.结果 50、100、200 nmol/L依维莫司处理COLO-16细胞12、24 h后,mTOR 2448位点和2481位点的磷酸化水平降低,Rictor 1135位点磷酸化水平也降低.然而,下游信号ULK1蛋白的ser757位点的磷酸化水平、P70 S6激酶的thr389位点的磷酸化水平以及PKCα的thr638/641位点磷酸化水平的变化并不显著.依维莫司处理对Akt的总蛋白水平和磷酸化水平无明显影响.顺铂处理COLO-16细胞12、24 h后,Rictor的thr1135位点磷酸化水平和Chk1的ser345位点磷酸化水平明显升高,但依维莫司单独处理无类似效应.当依维莫司与顺铂联合处理后12和24 h,相对于顺铂单独处理的细胞,上调的Chk1和Rictor磷酸化水平受到明显抑制.结论 COLO-16细胞mTOR信号对依维莫司处理敏感,但其下游信号并非同步产生级联反应.依维莫司可能通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡,但无加重顺铂所导致的DNA损伤.
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Chk1基因对人卵巢癌细胞HO8910增殖及细胞周期调控的影响及可能机制
目的:探讨siRNA沉默检测点激酶1(Chk1)基因对人卵巢癌细胞HO8910增殖和周期调控的影响及其作用机制.方法:设计并合成3条Chk1 siRNA干扰片段,转染进入卵巢癌细胞HO8910,Western blot检测转染前后HO8910细胞中Chk1蛋白的表达情况,筛选出有效片段.将Chk1 siRNA有效片段转染进入HO8910细胞,采用MTT法和流式细胞仪分析Chk1siRNA对HO8910细胞增殖和周期的影响;Western blot方法分别检测细胞周期相关基因CyclinA、CDK4、Cdc25A蛋白表达.结果:3个siRNA中,1条是有效siRNA.该有效Chk1 siRNA片段转染后,HO8910细胞中Chk1蛋白水平下降约53.6％,明显低于未转染组和脂质体转染组(P=0.000).转染48 h后,Chk1 siRNA转染组HO8910细胞增殖活性下降,抑制率为(52.1±5.1)％,明显高于脂质体转染组的(7.6±3.8)％(P=0.000).流式细胞仪检测显示Chk1 siRNA转染组HO8910细胞G2/M期比例为(5.03±2.62)％,明显低于未转染组(19.35±2.19)％和脂质体转染组(19.76±2.67)％(P=0.000).Western blot结果显示转染Chk1 siRNA后,细胞内与细胞周期相关的CyclinA、CDK4、Cdc25A蛋白水平表达明显增强,与未转染组和脂质体组比较,差异有统计学意义(P=0.000).结论:siRNA沉默Chk1基因后,可明显抑制卵巢癌细胞HO8910细胞的增殖,其抑制增殖作用与减弱G2/M期阻滞有关.
