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凉血解毒方及拆方对活化T淋巴细胞致角质形成细胞增殖及分泌细胞因子的影响
目的:观察凉血解毒方全方及拆方对活化T淋巴细胞致角质形成细胞增殖和分泌细胞因子的影响.方法:制备大鼠含药血清;将PDB刺激后的T淋巴细胞与Colo-16细胞共同培养,同时加入含药血清作用24 h,采用MTT法检测细胞增殖,采用ELISA法检测细胞因子TNF-α,sICAM-1和IFN-γ.结果:凉血解毒方对活化T淋巴细胞诱导的Colo-16细胞增殖具有明显的抑制作用,其中全方组和凉血组差异显著(P＜0.01).活化T淋巴细胞作用于Colo-16细胞24h后,sICAM-1,TNF-α,IFN-γ均明显升高,凉血解毒全方和凉血方、解毒方可明显降低sICAM-1,TNF-α,IFN-γ,而全方组药效为显著.结论:临床治疗银屑病有效中药复方凉血解毒方能够显著抑制活化T淋巴细胞介导的角质形成细胞增殖及细胞因子的分泌.
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环氧合酶-2反义寡核苷酸对鳞状细胞癌Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2表达的影响
目的:研究环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AsODN)对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)表达的影响.方法:免疫细胞化学法检测Colo-16细胞中COX-2蛋白表达;免疫荧光显微镜观察转染情况;蛋白免疫印迹(Western blot)及半定量反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测Colo-16细胞MMP-2蛋白和MMP-2mRNA表达水平.结果:Colo-16细胞中COX-2蛋白阳性表达,并分布在胞质、胞核;Colo-16细胞胞质和胞核可见荧光标记的COX-2无义寡核苷酸、反义寡核苷酸;Western blot及RT-PCR检测结果显示COX-2反义寡核苷酸作用Colo-16细胞48 h后,MMP-2表达显著下调(P<0.05).结论:COX-2反义寡核苷酸能有效下调Colo-16细胞MMP-2表达,提示COX-2反义寡核苷酸可能通过抑制MMP-2表达来阻断皮肤鳞状细胞癌的浸润、转移.
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他扎罗汀对Colo-16细胞体外增殖的影响及其机制的研究
目的:研究他扎罗汀对体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的影响,并探讨其机制.方法:用不同浓度的他扎罗汀处理Colo-16细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定Colo-16细胞增殖活性;免疫组化染色技术及免疫印迹法分别测定Colo-16细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平.结果:不同浓度的他扎罗汀对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用,其抑制作用呈明显的时效和量效关系(P<0.05);他扎罗汀作用Colo-16细胞后,Bcl-2蛋白表达明显下调,Bax表达明显增强.结论:他扎罗汀能抑制皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞的增殖,其机制与Bcl-2蛋白表达下调和Bax表达增加有关.
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三氧化二砷诱导人鳞状细胞癌细胞凋亡的研究
目的:研究三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)诱导人鳞状细胞癌细胞系Colo-16细胞凋亡,探讨As2O3对鳞状细胞癌的临床应用意义.方法:应用MTT分析、流式细胞仪分析和DNA凝胶电泳分析等实验方法,观察了As2O3诱导人鳞状细胞癌细系Colo-16细胞凋亡过程.结果:As2O3能同时诱导Colo-16细胞凋亡和坏死,并且具有浓度和时间依赖性.结论:As2O3可以诱导鳞癌细胞系Colo-16细胞凋亡,抑制细胞增生活跃,并有时间和浓度的依赖性.
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依维莫司对顺铂产生抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效作用研究
目的 探讨依维莫司是否增加顺铂对人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的杀伤效应.方法 分别用50、100、200 nmol/L的依维莫司和25 μmol/L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24h,用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平.Western印迹分析自噬标记性分子LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、Caspase 3和PARP剪切;LDH释放实验分析细胞死亡;Annexin V-EGFP染色分析细胞凋亡.结果 50、100、200 nmol/L的依维莫司处理COLO-16细胞后,12 h LC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.52±0.21、4.03±0.39、5.05±0.22,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与未用药物处理的对照组(2.07±0.05)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).24 hLC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.38±0.26、3.29±0.06、6.57±0.16,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与对照组(2.61％±0.16％)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 nmol/L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12h后,LC3-Ⅱ与β肌动蛋白的比值分别为1.26±0.40、1.16±0.34、1.21±0.39,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.19±0.27)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).100 nmol/L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2.06±0.61,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.68±0.62)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).依维莫司与顺铂联合处理24 h细胞死亡率42.58％±0.93％,高于顺铂单独处理的细胞(死亡率18.20％±1.46％),差异有统计学意义.依维莫司联合顺铂处理与顺铂单独处理细胞相比,Caspase 3和PARP剪切、Annexin V标记细胞数以及LC3-Ⅱ形成均无统计学差异(P＞0.05).结论 依维莫司增强顺铂诱导COLO-1细胞死亡,这种效应不依赖于凋亡和自噬调控.
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依维莫司与顺铂协同损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞机制的初步研究
目的 探讨依维莫司与顺铂联合损伤人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的分子机制.方法 依维莫司处理细胞后的信号通路实验分为对照组、50、100、200 nmol/L依维莫司处理组4组.依维莫司与顺铂联合处理的机制实验分为对照组、50 nmol/L依维莫司、25 μmol/L顺铂、50 nmol/L依维莫司+ 25 μmol/L顺铂处理细胞组4组.通过Western印迹进行mTOR、Akt、DNA损伤相关信号以及Chk通路分析.结果 50、100、200 nmol/L依维莫司处理COLO-16细胞12、24 h后,mTOR 2448位点和2481位点的磷酸化水平降低,Rictor 1135位点磷酸化水平也降低.然而,下游信号ULK1蛋白的ser757位点的磷酸化水平、P70 S6激酶的thr389位点的磷酸化水平以及PKCα的thr638/641位点磷酸化水平的变化并不显著.依维莫司处理对Akt的总蛋白水平和磷酸化水平无明显影响.顺铂处理COLO-16细胞12、24 h后,Rictor的thr1135位点磷酸化水平和Chk1的ser345位点磷酸化水平明显升高,但依维莫司单独处理无类似效应.当依维莫司与顺铂联合处理后12和24 h,相对于顺铂单独处理的细胞,上调的Chk1和Rictor磷酸化水平受到明显抑制.结论 COLO-16细胞mTOR信号对依维莫司处理敏感,但其下游信号并非同步产生级联反应.依维莫司可能通过抑制检测点激酶1的激活增强顺铂诱导COLO-16细胞死亡,但无加重顺铂所导致的DNA损伤.
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环氧合酶-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞增殖及环氧合酶-2表达的影响
目的 研究环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(AsODN)对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的抑制作用及COX-2表达的影响.方法 人工合成COX-2 AsODN,利用脂质体将不同浓度(50,100,200,400 nmol/L)反义寡核苷酸转染入Colo-16细胞,免疫荧光显微镜观察转染情况;采用噻唑蓝(MTT)法检测Colo-16细胞的增殖情况;Western印迹及半定量逆转录PCR检测Colo-16细胞COX-2蛋白和mRNA表达水平.结果 不同浓度的COX-2 AsODN对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用(P<0.05).400 nmol/L反义组在48 h抑制率高,达60.3%;COX-2 AsODN转染Colo-16细胞后,COX-2蛋白和mRNA表达明显下调,50、100、200、400 nmol/L组COX-2蛋白灰度值分别为0.763±0.070、0.600±0.065、0.430±0.074、0.251±0.045,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);COX-2 mRNA表达量随COX-2 AsODN浓度的增加而减少,50、100、200、400 nmol/L组COX-2 mRNA灰度值分别是0.778±0.025、0.602±0.041、0.417±0.031、0.297±0.051,各组间COX-2 mRNA表达差异有统计学意义(F=132.48,P<0.01).结论 COX-2 AsODN对Colo-16细胞的体外增殖有抑制作用,并能下调COX-2蛋白及其mRNA在Colo-16细胞中的表达,提示COX-2 AsODN有潜在治疗皮肤鳞状细胞癌的作用.
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西罗莫司体外诱导Colo-16细胞凋亡的研究
目的 研究西罗莫司对体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞凋亡的影响. 方法 用不同浓度的西罗莫司处理Colo-16细胞,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测西罗莫司对Colo-16细胞体外增殖的影响;AnnexinV-FITC和PI双染检测Colo-16细胞凋亡率;Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定Bcl-2、Bax mRNA的表达. 结果 不同浓度的西罗莫司对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用,这种抑制作用与西罗莫司的作用时间和剂量呈明显的依赖关系(P<0.05).西罗莫司显著增加Colo-16细胞的早期凋亡,西罗莫司(50,100,150,200 nmol/L)作用48 h后诱导Colo-16细胞的早期凋亡率分别为7.26%±0.26%、8.34%±0.19%、9.86%±0.14%、11.92%±0.15%,与对照组1.53%±0.09%比较,差异有统计学意义(P<0.05),且Colo-16细胞早期凋亡率与西罗莫司浓度呈剂量依赖关系(r=0.955,P=0.000).荧光染色可见细胞核染色质凝聚、边集、核裂解的形态学改变;Bcl-2 mRNA表达显著下调而Bax mRNA的表达显著增强. 结论 西罗莫司在体外能诱导Colo-16细胞凋亡,其发生机制可能与其调节Bel-2、Bax等凋亡调控基因的表达有关.
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他扎罗汀体外诱导Colo-16细胞凋亡的研究
目的:研究他扎罗汀诱导体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞的凋亡.方法:用不同浓度的他扎罗汀处理Colo-16细胞,流式细胞术检测Colo-16细胞早期凋亡率;Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;印迹杂交法测定caspase 3蛋白表达水平;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定caspase 3 mRNA的表达.结果:他扎罗汀显著增加Colo-16细胞的早期凋亡,且Colo-16细胞早期凋亡率与他扎罗汀呈浓度依赖性(P<0.05);荧光染色可见细胞核染色质固缩、核破碎;活化的caspase 3表达显著增强,caspase 3 mRNA表达显著增强.结论:他扎罗汀在体外可诱导Colo-16细胞凋亡,caspase 3的活化参与此凋亡过程.
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消银解毒饮及拆方对角质形成细胞COLO-16凋亡的调控作用
本研究以角质形成细胞株COLO-16为研究对象,用流式细胞仪分析了消银解毒饮及其拆方后的凉血、解毒和祛风除湿等三组主要成份含药血清对其凋亡的诱导作用.结果表明消银解毒饮能诱导COLO-16细胞的凋亡,诱导角质形成细胞的凋亡可能是其治疗银屑病的机制之一.
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消银解毒饮及拆方对角质形成细胞COLO-16增殖的调控作用
探讨消银解毒饮是否对角质形成细胞的增殖具有直接作用;以及消银解毒饮中凉血、解毒、祛风除湿等三组主要成分在治疗银屑病中所起的作用.本研究以角质形成细胞株COLO-16为研究对象;用四唑盐比色法观察了消银解毒饮及拆方后各组药物血清对COLO-16细胞增殖的影响.结果表明消银解毒组和凉血方组体外培养COLO-16细胞的存活率明显降低,而且存活率与含药血清浓度呈负相关.
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COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞生长及c-myc基因表达的影响
目的 探讨脂质体介导环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AsODN)对皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞生长及对c-myc表达的影响.方法 将COX-2无义(Nonsense oligodeoxynucleotide, NsODN)、反义寡核苷酸用脂质体分别导入Colo-16细胞中.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞体生长曲线的影响;Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测c-myc蛋白表达的变化.结果 COX-2反义寡核苷酸作用于Colo-16细胞后, 细胞增殖能力受到抑制,荧光染色可见细胞核染色质边集、固缩、核碎裂的凋亡形态学改变;c-myc表达明显下调.结论 COX-2反义寡核苷核酸能够抑制Colo-16细胞体外增殖,诱导Colo-16细胞凋亡, 并能显著下调c-myc表达.
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雷帕霉素对Colo-16细胞系Stat3表达的影响
目的 研究雷帕霉素对皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞系Stat3表达的影响.方法 用不同浓度的雷帕霉素处理Colo-16细胞,Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;Western-blotting法检测Colo-16细胞Stat3,P-Stat3蛋白表达水平.结果 雷帕霉素能够诱导Colo-16细胞凋亡,荧光染色可见细胞核染色质凝聚、核裂解的形态学改变;在雷帕霉素作用后Colo-16细胞Stat3,P-Stat3表达显著下调.结论 雷帕霉素能诱导Colo-16细胞凋亡,其作用机制可能与Stat3表达下调有关.
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表皮生长因子受体特异性shRNA对Colo-16细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨用特异性短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达对鳞状细胞癌Colo-16细胞凋亡的影响及其可能的机制.方法 构建EGFR特异性shRNA表达载体并转染Colo-16细胞,Western blot检测细胞内EGFR,Akt及NF-κB的表达水平;流式细胞仪检测Colo-16细胞的凋亡变化.结果 成功构建EGFR特异性shRNA表达载体并转染Colo-16细胞.转染特异性shRNA后,Colo-16细胞EGFR表达量的灰度值为0.42 ±0.03,与正常对照组(0.94±0.06)相比降低了55.57％,其差异具有统计学意义(P＜0.05).流式分析显示,下调EGFR表达可诱导Colo-16细胞凋亡,其凋亡率为12.65％,与对照组[凋亡率(0.11±0.03)％,(1.86±0.38)％和(2.26±0.25)％]比较差异具有统计学意义(P＜0.05).此外,抑制EGFR表达还下调了PI3 K/AKT信号通路蛋白Akt和NF-κB的表达.结论 用特异性shRNA抑制EGFR表达可能是一种有潜力的抗皮肤鳞癌的治疗策略.
