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重组双体化促血小板生成素模拟肽人血清白蛋白融合蛋白(HSA-TMP-TMP)体内生物活性与药效学研究
探索双体化重组人白蛋白与促血小板生成素模拟肽二联体融合蛋白(HSA-TMP-TMP)对正常小鼠促血小板生成活性的影响,并探讨双体化HSA-TMP-TMP对卡铂诱导继发性血小板减少症模型小鼠的治疗作用.给予正常小鼠不同剂量的双体化HSA-TMP-TMP,观察其促血小板生成活性;给予小鼠单次腹腔注射卡铂,建立化疗药物卡铂诱导的血小板减少症模型,并给予不同剂量的双体化HSA-TMP-TMP进行治疗,观察治疗效果.单体和双体HSA-TMP-TMP均可显著提高正常小鼠血小板计数水平,双体HSA-TMP-TMP提高正常小鼠血小板计数水平是单体HSA-TMP-TMP的1.57倍.而且,双体HSA-TMP-TMP对卡铂诱导继发性血小板减少症模型小鼠具有显著的治疗作用.双体HSA-TMP-TMP具有显著增加正常小鼠血小板计数水平的生物活性,而且对卡铂诱导的血小板减少症小鼠具有显著的治疗作用.
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促血小板生成素模拟肽二联体连接肽的筛选
比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(dTMP)的生物活性,筛选高生物活性dTMP的Linker设计.全基因合成4个dTMP基因,将片段克隆到pGEX-4T-1载体,构建重组表达载体pGEX-4T-1/dT-MP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),0.1 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白.超声细胞破碎仪破菌,Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析获得GST-dTMP融合蛋白,凝血酶酶切,再次亲和层析除去GST标签,收集目的dTMP肽片段,双荧光素酶法检测各目的肽片段的活性.通过实验,正确构建了4个不同的pGEX-4T-1/dTMP表达载体,经表达纯化得到了GST-dTMP融合蛋白,酶切后再次亲和层析纯化,并获得了相对分子质量与理论值3 920,3 640,3 610,3 430相符的4个dTMP肽片段,它们的活性大小依次为:dTMP-Linker3＞ dTMP-Linker4＞dTMP-Linker1＞dTMP-Linker2.实验发现,不同的连接肽显著影响dTMP肽片段的生物活性,该实验成功筛选到了活性较高的连接肽Linker3.
