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阿达木单抗抗原结合片段在大肠杆菌中的共分泌表达和纯化
构建阿达木单抗抗原结合片段(Fragment antigen binding,Fab)表达载体,使其在大肠杆菌内高效共分泌表达,周质空间中获得具有活性的目的蛋白.将带有信号肽的Fab片段重链与轻链克隆于带有双启动子的pETDuet-1载体内,BL21(DE3) Star宿主菌内利用IPTG低温诱导双基因共分泌表达,选用“渗透压冲击法”提取周质蛋白,色谱柱纯化,Western blot分析纯化结果,与纯化的人肿瘤坏死因子(TNF-α)相互作用进行活性分析.SDS-PAGE与Western blot分析在细胞周质中同时存在重链和轻链,大小与预期相符,ELISA试验显示Fab片段与TNF-α结合.结论:得到有活性的人源的阿达木单抗的Fab的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础.
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人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1特异性基因工程抗体Fab的筛选与特性
目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性、高亲和力的全人抗体Fab片段.方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性.结果:Western blot、免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA、荧光激活细胞分类术、免疫荧光分析、免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性.结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子.
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抗TNF-α蛋白Fab抗体的制备和鉴定
目的 制备人源性抗肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白的可溶性Fab抗体.方法 用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况,ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性.结果 筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Westem blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体;ELISA筛选出的2株抗体(TA-04、TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应.结论 成功制备并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体.
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双亲和柱分离纯化高纯度抗体Fab酶切片段
目的 建立利用抗原亲和柱及蛋白G亲和柱纯化抗体木瓜蛋白酶酶切产物中高纯度Fab片段的方法.方法 以抗体对应的抗原蛋白与NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow活化偶联填料偶联制备抗原免疫亲和层析柱,将抗体木瓜蛋白酶酶切产物分剐通过蛋白G柱及抗原亲和柱制备抗体的Fab片段.通过SDSPAGE电泳、ELISA测定及临床类风湿因子阳性血清的干扰实验鉴定其制备效果.结果 抗体木瓜蛋白酶酶切产物分别通过蛋白G柱及抗原亲和柱后可以依次去除抗体Fc片段及未切开的抗体、木瓜蛋白酶及失活的Fab抗体片段,终获得高纯度、高活性的Fab抗体片段.SDS-PAGE电泳、ELISA测定抗体Fc段被完全去除,双抗夹心ELISA检测能消除类风湿因子阳性血清导致的假阳性.结论 成功建立了双亲和柱分离纯化抗体Fab片段的方法,该方法适用于快速、高质量、大规模制备Fab抗体片段.
