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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2酵母双杂交载体构建及激活检测
目的: 为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用,构建pGADT7/ppGalNAc-T2载体,并转化酵母AH109进行激活检测.方法: 采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,亚克隆至酵母双杂交载体pGADT7,醋酸锂法转染酵母AH109,并进行激活检测.结果: 酶切图谱分析和基因测序证实pGADT7/ppGalNAc-T2载体构建成功.并转化酵母AH109,激活检测呈阴性.结论: 成功构建了pGADT7/ppGalNAc-T2载体,并进行了激活检测,为进一步研究ppGalNAc-T2的功能奠定了基础.
关键词： 多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶 O-糖基化 酵母双杂交 激活检测 -
血型糖蛋白AcDNA的克隆及其酵母双杂交系统BD端pGBkT1-GPA质粒的构建
目的:检测红细胞膜跨膜蛋白质--血型糖蛋白A(GPA)对酵母细胞是否有毒性及其能否激活检测基因,以进一步揭示GPA与带Ⅲ蛋白的相互关系.材料与方法:培养红白血病细胞(K562)直到细胞总数达到109以上,收获细胞,用于粗提核内容物的制备.收集增殖状态K562细胞10 mL,提取总RNA以oligo(dT)为引物反转录合成cDNA.参照GPA GENBANK数据库中检索到的序列设计引物,PCR扩增GPA cDNA.PCR产物纯化后,进行补平,平端连接于PUC19质粒上.将经过阳性选择的重组质粒纯化、测序.双酶切PUC19-GPA,产物电泳纯化后加入经相同过程双酶切的PGBKT7,连接产物转化E.coli DH5α.在含卡那霉素平板上筛选阳性重组子,小量提纯质粒,酶切,PCR鉴定.用醋酸锂法将PGBKT7-GPA转染酵母菌,进行细胞计数,计算转染效率,以观察GPA对酵母细胞蛋白表达的影响.结果与讨论:血型糖蛋白A对维持红细胞膜表面负电荷恒定、防止红细胞凝集有重要作用.近年研究表明GPA和红细胞膜上另一种跨膜蛋白--带Ⅲ蛋白在结构与功能上有相关性.酵母双杂交系统是近年发展起来的一种研究蛋白质之间相互作用的体系.该系统不仅可以研究两个已知蛋白的相互作用,而且可以通过构建诱饵蛋白基因从基因文库中筛选出未知基因.本研究采用RT-PCR方法从K562细胞中克隆出GPA的cDNA,重组酵母双杂交系统靶基因载体,构建成pGBKT7-GPA,并转染酵母菌AH109,经检测其对酵母细胞无毒性且不能激活检测基因.因此,pGBKT7-GPA可以作为酵母双杂交系统靶基因.选用RT-PCR技术,从K562细胞中克隆到GPA基因,为国内首次报道.我们曾在国内外首次报道一种新活性的蛋白酶.该酶的活性与带Ⅲ蛋白及GPA-C结构域有关.上述研究结果为进一步研究GPA与带Ⅲ蛋白相互关系打下良好基础.
