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人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定
目的:研究反义封闭ppGalNAc-T2基因表达对胃癌细胞GC7901细胞增殖以及肿瘤细胞生物学行为的影响,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901.方法:在对几种肿瘤细胞的ppGalNAc-T2基因的表达水平分析后,以高表达ppGalNAc-T2的人胃癌细胞GC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度ppGalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞GC7901细胞pp-GalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆.通过荧光显微镜、RT-PCR技术手段检测封闭反义ppGalNAc-T2基因RNA表达.结果:ppGalNAc-T2反义表达质粒载体pEGFP-FDT2和pEGFP-FXT2经限制性酶切及部分序列分析证明基因已正确插入载体中,荧光显微镜及RT-PCR显示转染成功.结论:成功构建了ppGalNAc-T2反义表达质粒载体,反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后,胃癌细胞GC7901ppGalNAc-T2的含量明显降低,为进一步研究ppGalNAc-T2奠定了基础.
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载绿色荧光蛋白基因壳聚糖纳米粒载体的制备和转染的研究
目的优化试验条件,制备合适的壳聚糖纳米粒,并连接上质粒,研究壳聚糖纳米粒对DNA的结合能力.方法以离子交联法制备壳聚糖纳米粒,并送激光微粒度仪及扫描电子显微镜检测,了解粒径的分布与形态;通过静电吸附作用连接上增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1(报告基因);经琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合能力,并通过紫外分光光度计检测其载药量和包埋率.结果微粒度分析仪及电镜检测证实壳聚糖纳米粒呈均匀分散的球形颗粒,小粒径为50 nm,平均直径为95 nm.琼脂糖凝胶电泳的结果显示壳聚糖纳米粒能有效地结合增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,紫外分光光度计检测不同比例结合(纳米粒:质粒)pEGFP-C1质粒的壳聚糖纳米粒的包埋率分别为:100%(50:10),100%(50:20),92%(50:75)和65%(50:100).结论制备出粒径较小、均匀的壳聚糖纳米粒,并且壳聚糖纳米粒能有效地连接上质粒.
关键词： 壳聚糖 纳米粒 pEGFP-C1质粒
