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稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的急性髓细胞白血病细胞株的构建及鉴定
构建稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的急性髓细胞白血病细胞(AML)株,为研究FLT3-ITD在急性髓细胞白血病中的作用和以FLIT3为靶点的治疗提供一种新的体外模型.筛选临床上FLT3-ITD突变的AML患者,选取mutant/wt比值高的FLT3-ITD突变作为克隆对象,PCR扩增FLT3基因全长.然后通过同源重组的方法构建FLT3-ITD/FIV慢病毒载体并包病毒,收集病毒液上清液进行K562白血病细胞株感染,通过流式细胞分选术筛选阳性转染细胞.收集阳性转染细胞做Western blot验证阳性质粒的表达情况.207名AML患者中有42例FLT3-ITD突变,成功扩增出了mutant/wt比值高的FLT3-ITD突变患者的FLT3基因全长.双酶切FIV载体和模板DNA,连接以及感受态细胞转化筛选出阳性重组子,双酶切鉴定和测序结果验证.慢病毒成功感染K562白血病细胞株,用流式细胞分选术筛选出了稳定感染的细胞,且该细胞可以传代、扩增.同时,稳定感染细胞的Western blot鉴定也证实了阳性质粒的表达情况.通过筛选FLT3-ITD突变的AML患者,成功构建了稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的白血病细胞株,为研究FLT3-ITD在AML发病中的作用以及针对FLT3-ITD为靶点的药物筛选治疗等提供了一个稳定的体外细胞模型.
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恶性髓系肿瘤细胞部分岩藻糖转移酶基因表达研究
目的 研究恶性髓系肿瘤细胞中部分岩藻糖转移酶(FUT1-3、FUT6-7)基因的相对表达情况.方法 应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HL-60细胞及31名急性髓细胞白血病(AML)患者与骨髓增生异常综合征(MDS)患者(患者组)的FUT1-3、FUT5-7基因的相对表达情况,同时以正常CD34+细胞作为HL-60细胞的正常对照、以25名健康体检者作为患者组的正常对照.结果 FUT1-3、FUT6-7基因在HL-60细胞及其对照组的相对表达分别为:0.30±0.03 vs 1.08±0.06、0.68±0.05 vs 1.20±0.14、0.68±0.04 vs 1.00±0.05、0.82±0.03 vs 1.00±0.05、0.59±0.12 vs 1.02±0.15(P ＜0.01).FUT1、FUT3基因在患者组与对照组的相对表达分别为:0.85±0.67 vs 1.31±0.5、0.53±0.48 vs 1.34±0.69(P ＜0.05);FUT2、FUT6、FUT7基因的相对表达量在患者组与对照组间无明显差异(P＞0.05).FUT1-3、FUT6-7基因在AML患者(n=13)与MDS患者(n=18)间的相对表达量差异亦不明显(P＞0.05).结论 FUT1-3、FUT6-7基因在恶性髓系肿瘤细胞HL-60及AML与MDS患者中出现不同程度的相对表达减弱,二者间部分具有关联性.
