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问号钩端螺旋体对主要细胞外基质分子黏附作用及其差异性研究
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对细胞外基质(ECM)分子的黏附作用及其差异.方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A.1、L929和Vero细胞感染模型,采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法,了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效果.建立多种ELISAs,检测问号钩体56601株黏附ECM分子层粘连蛋白(LN)、纤维纤连蛋白(FN)、核心蛋白多糖(DEN)及胶原蛋白1、2、4(COL1,2,4)的作用,采用竞争性抑制试验对上述实验结果进行验证.结果:问号钩体56601株能以一端或两端黏附于L929、J774A.1和Vero细胞的ECM部位.问号钩体56601株可与上述6种ECM分子发生黏附,其中对COL1、LN、COL4的黏附作用较强.问号钩体56601株分别与上述6种ECM分子预孵育后,对相应ECM分子的黏附作用明显下降.结论:ECM是问号钩体黏附宿主细胞的主要部位.LN、FN、DEN、COL1、COL2、COL 4均是问号钩体黏附的受体分子,但问号钩体对不同ECM分子的黏附效果有一定差异.
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问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞凋亡及caspase-3、-6活化对凋亡的影响
目的:了解问号钩端螺旋体(钩体)诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)凋亡的作用,以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响.方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A.1细胞感染模型.采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况.分别采用荧光比色法和Western Blot,检测感染细胞caspase-3、-6活性及其底物(PARA和LaminA/C)剪切情况.结果:多种不同浓度的问号钩体赖株感染均可使J774A.1细胞发生凋亡,其中以问号钩体∶细胞=100∶1的比例感染时凋亡率高(48.81%±5.95%).感染细胞caspase-3和-6大活性分别为(1453.41±36.07)FU和(618.65±39.82)FU,是未感染细胞的16.38和9.98倍.感染细胞的PARP和Lamin A/C均被剪切.Caspase-3、-6抑制剂对问号钩体赖株诱导的J774A.1细胞凋亡有明显的阻断作用.结论:问号钩体可诱导J774A.1细胞凋亡,caspase-3和-6与该细胞凋亡密切相关.
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fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性.方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因.构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA.采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株,并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定.采用小鼠单核-巨噬细胞J774A.1黏附试验和流式细胞术,检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601siRNA-R2株黏附细胞,及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化.结果:所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和100%,所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同.56601fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长,PCR和测序结果证实56601fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因.56601fliR-Kana株fliR基因mRNA水平明显下降(P<0.01),56601siRNA-R2株fliR基因mRNA水平也低于野生株(P<0.05).56601fliR-Kana和56601siRNA-R2黏附J774A.1细胞的能力基本消失,诱导J774A.1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱(P<0.01).结论:fliR基因是问号钩体毒力相关基因,其功能与问号钩体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关.
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问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞FasL/Fas表达上调及FasL/Fas相关细胞凋亡的研究
目的:了解FasL/Fas途径参与问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导细胞凋亡及其FasL/Fas表达水平变化.方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核-巨噬细胞J774A.1模型.采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征,流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用.PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法,观察问号钩体56601株感染细胞FasL/Fas表达情况.采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL/Fas表达水平.结果:问号钩体56601株感染J774A.1细胞4 h时,部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象;感染24 h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解.问号钩体56601株感染J774A.1细胞4 h和24 h的凋亡率分别为53.6%和64.31%.FasL中和抗体预处理细胞后,问号钩体56601株感染细胞4 h或24 h的凋亡率分别为10.27%和15.90%.J774A.1细胞被问号钩体56601株感染后4和24 h,FasL表达率分别从感染前的4.19%上升至21.69%和65.70%,Fas表达率分别从感染前的12.88%上升至91.96%和88.01%.结论:诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A.1细胞的重要机制.问号钩体可上调靶细胞FasL/Fas表达水平,并通过FasL/Fas途径诱导J774A.1细胞凋亡.
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问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究
目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)主要外膜蛋白OmpL1、LipL32和LipL41免疫功能表位及其致炎作用.方法:建立Ni-NTA亲和层析法,提取不同基因型表达的目的重组蛋白rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2.采用SDS-PAGE检测上述目的重组蛋白的表达情况和提取物纯度.分别采用Signal P3.0预测服务器Signal P-NN软件、Propred MHC class-Ⅱ binding peptide prediction-ProPred预测服务器EMBOSS软件,对上述蛋白的信号肽、MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位进行分析.以人脐静脉内皮细胞株EVC-304为效应细胞,采用ELISA检测上述目的重组蛋白诱导人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1、IL-8和TNF-α的作用.结果:在IPTG诱导下,所构建的原核表达系统可有效表达rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2,其产量分别约占细菌总蛋白的30%和15%、40%和35%、15%和10%.提纯后的目的重组蛋白SDS-PAGE后均仅见单一的蛋白条带.OmpL1s、LipL32/1和LipL32/2、LipL41s的信号肽分别位于N端1-24、1-21和1-24、1-24位氨基酸残基.OmpL1s、LipL32s和LipL41s分别有2、2和1个相同的主要MHC-Ⅱ结合肽和B细胞表位,其中OmpL1/2另有1个主要MHC-Ⅱ等位基因结合肽和B细胞表位(59-78).不同浓度的OmpL1s、LipL32s和LipL41s均可明显促进人静脉内皮细胞株EVC-304合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α(P<0.05).其中IL-1α水平以作用24 h时高,然后下降;IL-8和TNF-α水平则作用48 h高于24 h.结论:问号钩体ompL1/1、lipL32或lipL41不同基因型的表达产物均存在相似的MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位.rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2对EVC-304细胞均有直接的致炎作用.
关键词： 钩端螺旋体 问号/致病力 细菌外膜蛋白/致病力 免疫显性表位/分析 细胞因子 -
问号钩端螺旋体磷脂酶C的活性及其内化时细胞内游离Ca2+水平的变化
目的:了解不同毒力的钩端螺旋体(简称钩体)对细胞内游离Ca2+水平的影响及其磷脂酶C(PLC)活性与细胞内游离Ca2+水平的关系.方法:建立问号钩体Vero和J774A.1细胞感染模型.采用fluo-3/AM胞内Ca2+特异荧光标记激光共聚焦技术,检测强毒力的问号钩体黄疸出血群赖型56601株和弱毒力的波摩那群波摩那型56608株及无毒力的双曲钩体Patoc Ⅰ株作用的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2+水平.以[3H]PIP2为底物,采用同位素法检测上述3株钩体培养物上清、胞浆和胞膜中PLC的活性.结果:正常Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2+基础值分别为(102.3±8.2)%和(105.9±7.3)%,在观察时间内Patoc Ⅰ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于(102.3±8.2)%～(102.2±8.3)%.问号钩体56601株感染的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2+浓度呈双峰型增高,第一峰荧光强度变化百分数分别为(430.5±35.7)%和(747.5±18.5)%,第二峰荧光强度变化百分数分别为(380.6±17.4)%和(804.6±22.4)%.问号钩体56608株感染Vero和J774A.1细胞,其胞内游离Ca2+浓度均呈缓慢的单一坡型升高,其大荧光强度变化百分数分别为(235.0±19.3)%和(402.4±17.4)%,明显小于56601株问号钩体(P<0.01).问号钩体56601株和56608株及双曲钩体Patoc Ⅰ株的培养物上清、胞浆蛋白和胞膜蛋白成分中均显示PLC活性(P<0.05).结论:不同毒力的问号钩体所感染细胞的胞内游离Ca2+水平及其峰型有明显差异,而且与被感染细胞的种类有关,与PLC活性无关.
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问号钩端螺旋体诱导的Vero和J774A.1细胞的凋亡和超微结构病变
目的:探讨不同毒力的钩体黏附和侵入宿主细胞能力及其病理变化.方法:建立Fontana镀银染色法用于观察问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株和双曲钩体三堡隆群patoc型Patoc Ⅰ株黏附Vero和J774A.1细胞的能力;采用电镜技术观察感染细胞的超微结构病变;采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术,检测紫外线灭活前后的上述钩体菌株诱导Vero和J774A.1细胞凋亡或坏死的情况.结果:问号钩体56601和56608株对Vero细胞的黏附率分别为24.2%和22.9%(P＞0.05);对J774A.1细胞的黏附率分别为49.0%和46.9%(P＞0.05);双曲钩体Patoc Ⅰ株不能黏附细胞.两株问号钩体侵入细胞后形成含有钩体的特殊吞噬泡,并引起相似的细胞超微结构病变,如细胞核染色质浓缩或溶解、细胞空泡变性、线粒体肿胀及线粒体嵴消失、内质网肿胀和膜旁核糖体消失等.灭活前的56601和56608株引起的Vero细胞凋亡率分别为84.4%和82.8%,灭活后则分别为77.9%和86.1%.灭活前后的56601株均以诱导Vero细胞晚期凋亡为主,其凋亡率分别68.0%和52.9%.灭活前后的56608株均以诱导Vero细胞早期凋亡为主,其凋亡率分别为64.1%和50.1%.在J774A.1细胞中,紫外线灭活前后的56601和56608株主要引起细胞坏死,其次是细胞凋亡,均以晚期凋亡为主.结论:所建立的Fontana镀银染色法可用于观察问号钩体的细胞黏附.问号钩体以内吞方式侵入细胞,并导致细胞超微结构病变.问号钩体诱导细胞坏死或凋亡可因细胞种类不同而异,与其毒力无明显关系.
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问号钩端螺旋体致病机制和新型疫苗及细菌耐药性研究进展
钩端螺旋体(简称钩体)病是重要的人兽共患传染病之一,但其致病机制至今不明,目前也无可预防所有问号钩体血清群、型感染的通用型疫苗.细菌耐药性一直是医学微生物学和传染病学关注的重大问题之一,近年发现二元信号传导系统(TCS)与某些细菌耐药性密切相关.根据近年国内外有关研究资料,文中就问号钩体致病物质及其作用机制、相关信号传导通路及其致病意义,以及TCS在肺炎链球菌对青霉素和头孢胺噻耐药性形成、结核分枝杆菌对异烟肼和乙胺丁醇耐药性影响的新研究进展进行简要介绍.
