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动脉平滑肌细胞的钙池操纵钙通道对细胞自噬的调节
目的：探讨大鼠动脉平滑肌细胞A7 R5上钙池操纵性钙通道( store-operated calcium channel, SOCC)对细胞自噬的影响。方法在293T细胞中包装含有STIM1、Orai1基因的慢病毒,将获得的慢病毒 LV-STIM1、LV-Orai1感染大鼠A7R5细胞,Western blot检测感染前后STIM1、Orai1蛋白表达及细胞自噬调节蛋白Beclin-1的表达。慢病毒感染A7R5后饥饿处理6 h或雷帕霉素处理24 h,Western blot检测处理后各组自噬相关蛋白LC3的蛋白表达量。结果重组载体pLV-STIM1、pLV-Orai1经双酶切鉴定正确。在293T成功包装慢病毒LV-STIM1、LV-Orai1。病毒感染 A7R5后,与对照组相比,STIM1、Orai1蛋白表达量分别上调96%和163%,而自噬调节蛋白Beclin 1下调64%。饥饿或雷帕霉素处理可明显增加细胞自噬水平,体现为自噬标志蛋白LC3-Ⅱ含量增加,而慢病毒感染STIM1、Orai1可明显抑制饥饿或雷帕霉素诱导的细胞自噬。结论在大鼠动脉平滑肌A7 R5细胞过表达钙池操纵钙通道分子STIM1和Orai1可使细胞自噬水平降低。这一分子机制可能与肺动脉高压发病相关。
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HT22细胞缺血再灌注损伤后钙池操纵钙通道蛋白中STIM的表达及意义
目的 探讨钙池操纵钙通道蛋白组成成分——基质相互作用因子(STIM)在细胞缺血再灌注损伤后的表达变化及意义. 方法 将HT22细胞系随机分为正常对照组及缺血再灌注损伤后1、3、6、12、24h组;正常对照组不做任何处理,缺血再灌注各组细胞通过无糖培养基和氮气箱内培养6h建模.利用荧光免疫组化法检测STIM1和STIM2的空间表达情况;利用实时定量PCR(RT-PCR)、Western blotting法检测STIM1和STIM2的蛋白及mRNA水平表达变化. 结果 (1)荧光免疫组织化学检测发现,缺血再灌注损伤后,特别是损伤后12 h,STIM1染色呈阳性,阳性染色呈颗粒状,分布在胞膜、胞浆和部分胞核上.而STIM2的阳性颗粒则主要表达在细胞核上;(2)RT-PCR检测发现,STIM1在正常对照组和缺血再灌注损伤后各组HT22细胞中高表达,但表达量差异无统计学意义(p＞0.05).与正常对照组比较,STIM2则在缺血再灌注损伤后1h、6h和24 h有3个表达高峰,表达量差异有统计学意义(P＜0.05).(3)Western blotting检测结果显示,STIM1持续稳定高表达,各组之间差异无统计学意义(p＜0.05).STIM2蛋白在缺血再灌注损伤后各组中均明显升高,其中1h、3h、6h及12h组与正常对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05). 结论 缺血性损伤后,STIM1和STIM2均在HT22细胞上表达,但其空间和时间表达变化规律不同,可能通过影响钙库调控的钙内流等机制在脑缺血性损伤的病理生理过程中发挥作用.
