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人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测
目的 克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性.方法 利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件.以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5′非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒.用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达.同时,将上述MANF基因5′非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达.结果 重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白; pGL3-MANF-5F重组质粒在N2A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论 已成功克隆了MANF基因的5′端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础.
