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佐剂性关节炎大鼠滑膜及血清中MANF的表达及其与炎症的相关性
目的 观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte- derived neurotrophic factor, MANF)在佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠膝关节滑膜和血清中的表达情况,分析MANF表达与关节炎症是否具有相关性.方法 SD大鼠足趾皮内注射弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant,FCA)制备AA模型;足容积法测量继发侧足肿胀度,关节炎指数(arthritis index, AI)评价AA严重程度,HE染色观察膝关节病理学变化;分别采用Western blot和RT-PCR法检测致炎后不同时期继发侧膝关节滑膜组织中MANF和内质网应激标志蛋白BiP、CHOP的蛋白和mR-NA水平;ELISA法检测致炎后不同时期血清中MANF、C-反应蛋白(C- reactive protein, CRP)、白细胞介素1β(interleu-kin-1 β, IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)水平,并进行相关性分析.结果 AA大鼠模型建立成功,致炎d 2滑膜组织中BiP表达明显升高,到d 28稍有下降;MANF表达在致炎 d 2略有升高并保持稳定,d 14表达明显上调,随后逐渐下降;而CHOP则保持低水平缓慢上升的趋势;致炎d 14血清中MANF水平明显增高,随后逐渐下降,d 28仍高于正常水平;CRP与MANF变化趋势基本一致;在AA大鼠继发性反应期,MANF水平与关节炎症状、血清IL-1β和TNF-α水平呈负相关.结论 关节炎症能诱导MANF表达和分泌,且MANF水平与关节炎症进展和程度密切相关.
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中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子对糖氧剥夺/再灌注诱导的SH-SY5 Y细胞损伤的保护作用
目的：研究中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子( mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF )对糖氧剥夺/再灌注( oxygen-glucose deprivation /reperfusion, OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞( SH-SY5Y)损伤的保护作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞,对细胞进行糖氧剥夺(OGD)6 h,再灌注(R)12 h。在再灌注时期,根据是否给予重组人MANF蛋白处理(2μmol·L-1,12 h),将细胞分为正常对照组( NC)、NC+MANF组、OGD/R组和OGD/R+MANF组。随后光学显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态的改变,MTT法检测细胞存活率, PI染色法检测细胞死亡率,免疫印迹法检测内源性MANF蛋白、内质网( ER)应激相关蛋白 GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α及促凋亡蛋白 cleaved caspase-3和 CHOP 的表达。结果光学显微镜下可见OGD/R组SH-SY5Y细胞胞体变小、变圆,突起缩短或消失。进一步研究发现, MANF 能明显改善 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y细胞存活率下降和死亡率增加。免疫印迹法检测发现：OGD/R组细胞内源性MANF蛋白表达增高；ER应激相关蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α表达增高；促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达明显高于NC组。给予重组人 MANF 蛋白可降低 OGD/R 组 GRP78/BiP、CHOP 及cleaved caspase-3的表达水平。结论 OGD/R 可诱导凋亡性ER应激；MANF蛋白可通过抑制OGD/R诱导的凋亡性ER应激而对SH-SY5Y细胞具有保护作用。
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MANF对神经细胞中tau蛋白过度磷酸化的抑制作用
目的 观察MANF是否可以抑制冈田酸诱导的N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,以了解MANF神经保护作用的机制.方法 采用体外培养小鼠神经母瘤细胞株N2a,以冈田酸(okadaic aicd,OA)作为诱导剂诱导N2a细胞中tau蛋白过度磷酸化,在加入重组人MANF蛋白干预或转染MANF过表达质粒及siRNA后,用MTT法检测细胞增殖活性的变化,并用AT-8抗体检测tau蛋白ser202/Thr205位点的磷酸化水平变化.结果 N2a细胞在加入重组人MANF蛋白预处理4 h后加入OA诱导24 h后,经Western blot和MTT法检测发现,重组人MANF蛋白能明显抑制N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,并可促进N2a细胞的增殖活性;在转染MANF过表达质粒后,N2a细胞中 OA诱导的过度磷酸化tau蛋白减少,且细胞活性增加;与此相反,转染siRNA下调内源性的MANF的表达则能促进N2a细胞中的tau蛋白过度磷酸化,并抑制细胞活性.结论 MANF可以抑制神经细胞中tau蛋白过度磷酸化,这可能是其发挥神经保护作用的原因之一.
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人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测
目的 克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性.方法 利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件.以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5′非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒.用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达.同时,将上述MANF基因5′非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达.结果 重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白; pGL3-MANF-5F重组质粒在N2A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论 已成功克隆了MANF基因的5′端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础.
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MANF减轻帕金森病大鼠模型的神经损伤
目的 观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)对6-OHDA引起的多巴胺能神经元损伤的影响.方法 表达纯化人重组MANF蛋白;将6-OHDA立体定位注射至大鼠纹状体区,制备大鼠帕金森模型;将3个剂量(5、10、20 μg)纯化的MANF注射至模型大鼠纹状体区,腹腔注射司来吉兰作为阳性对照,纹状体直接注射PBS作为阴性对照;计数大鼠给药前后由阿扑吗啡诱导的由损伤侧向健侧不对称的旋转次数;免疫组化方法检测各大鼠黑质、纹状体部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元和神经纤维.结果 10 μg MANF组大鼠的旋转行为较PBS组明显减少,效果与司来吉兰组相近.MANF注射后对黑质部位TH阳性神经元数量和纹状体部位TH阳性神经纤维数量均有不同程度的明显恢复.结论 MANF能减轻6-OHDA引起的帕金森模型大鼠的神经损伤.
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MANF蛋白表达水平与肝纤维化程度的相关性研究
目的：探讨中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)蛋白在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者肝纤维化发生发展中的作用及其与临床特点的相关性。方法采用相对和绝对定量同位素标记( ITRAQ)蛋白质组学和免疫组化法检测肝脏穿刺组织中MANF蛋白的表达,分析其表达水平与肝脏炎症纤维化分期的关系；采用实时荧光定量PCR技术检测正常对照( NC)、乙肝病毒携带者( ASC)、慢性乙型肝炎患者( CHB)及乙肝后肝硬化患者( LC)外周血白细胞中MANF mRNA的表达水平,分析其与不同阶段慢性HBV感染者的临床病毒学和生化学指标的相关性。结果 MANF蛋白主要在肝细胞质中表达,其表达水平随着肝脏炎症及纤维化的程度加重而升高。 NC 组、ASC 组和 CHB 组分别与LC组比较,MANF mRNA的表达差异均有统计学意义( P<0．01)。 MANF mRNA 的表达水平在乙肝病毒表面抗原(HBsAg)<1．5×106 IU/L、(1．5×106~2．0×107) IU/L和>2．0×107 IU/L 3组间差异有统计学意义(P<0．05)；在乙肝病毒e抗原( HBeAg)阳性组与阴性组之间差异有统计学意义(P<0．01)；在胆红素正常组与异常组之间差异有统计学意义( P <0．01)。结论 MANF 蛋白可能参与了慢性HBV感染者肝纤维化的发生发展,并与其临床特点相关。
