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有效抑制小胶质细胞上TLR4表达的siRNA筛选及转染复合物细胞毒性的检测
目的 筛选有效抑制小胶质细胞上TLR4(Toll-like receptor 4)表达的小干扰RNA(simall interference RNA,siRNA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性.方法 设计并合成针对TLR4的siRNA 4条(siRNA_(312),siRNA_(439),siRNA_(1495),siRNA_(2062))及1条与TLR4基因无同源性的带绿色荧光标记的阴性对照siRNA:在Lipofectamine~(TM) 2000介导下转染小胶质细胞.用RT-PCR方法测定干扰后小胶质细胞上TLR4 mRNA表达,Western blot方法测定干扰后TLR4蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA.采用MTT法检测转染复合物的细胞毒性.结果 ① siRNA(40 nmol·L~(-1))和Lipofectamine~(TM) 2000(1 μl)有较高的转染效率;②与阴性对照组相比,TLR4 siRNA(40 nmol·L~(-1))干扰小胶质细胞24 h后TLR4 mRNA的相对表达量降低,分别为:85%(siRNA_(439))、73%(siRNA_(312))、67%(siRNA_(1495))和33%(siRNA_(2062)).③ siRNA_(439)干扰小胶质细胞48 h后TLR4蛋白表达低(P<0.01).④ Lipofectamine~(TM) 2000 1 μl复合低于40 nmol·L~(-1)的siRNA的各组细胞存活率均在85%以上.结论 ① siRNA_(439)对小胶质细胞上TLR4表达的抑制效果大.② siRNA浓度40 nmol·L~(-1),Lipofectamine~(TM) 2000浓度1 μl,细胞毒性很低,适合转染.
