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siRNA-pool抑制大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8的表达
目的 观察siRNA-pool 对大鼠脊髓背角神经细胞 (rat neurons-dorsal spinal cord cells,RNdsc)上T细胞死亡偶联基因8(T-cell death-associated gene 8,TDAG8)表达的影响.方法 设计并合成针对TDAG8的siRNA 3对(siRNA63、siRNA341、siRNA897)及一条带绿色荧光标记的阴性对照siRNA.在阳离子聚合物纳米粒jetPEITM介导下转染RNdsc.RNdsc细胞随机分为正常(normal)组,载体(vehicle)组,阴性对照 (mismatch) 组,siRNA 50、100、200 pmol组.转染24 h 后,荧光显微镜下计算转染复合物的转染效率,用MTT法检测转染复合物的细胞毒性,采用real-time PCR及Western blot测定siRNA-pool的干扰效率.结果 采用jetPEITM作为转染介质转染效率高达98.9%.转染复合物的细胞毒性低,各组细胞成活率差异无统计学意义.siRNA 50、100、200 pmol可剂量依赖性地抑制TDAG8的表达,siRNA 200 pmol组对TDAG8 mRNA表达的抑制率达88%,对TDAG8蛋白的表达抑制率达73%.结论 siRNA-pool 能高效地抑制RNdsc上TDAG8的表达.
关键词： 小干扰RNA 大鼠脊髓背角神经细胞 T细胞死亡偶联基因8 表达 转染复合物 细胞毒性 -
有效抑制小胶质细胞上TLR4表达的siRNA筛选及转染复合物细胞毒性的检测
目的 筛选有效抑制小胶质细胞上TLR4(Toll-like receptor 4)表达的小干扰RNA(simall interference RNA,siRNA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性.方法 设计并合成针对TLR4的siRNA 4条(siRNA_(312),siRNA_(439),siRNA_(1495),siRNA_(2062))及1条与TLR4基因无同源性的带绿色荧光标记的阴性对照siRNA:在Lipofectamine~(TM) 2000介导下转染小胶质细胞.用RT-PCR方法测定干扰后小胶质细胞上TLR4 mRNA表达,Western blot方法测定干扰后TLR4蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA.采用MTT法检测转染复合物的细胞毒性.结果 ① siRNA(40 nmol·L~(-1))和Lipofectamine~(TM) 2000(1 μl)有较高的转染效率;②与阴性对照组相比,TLR4 siRNA(40 nmol·L~(-1))干扰小胶质细胞24 h后TLR4 mRNA的相对表达量降低,分别为:85%(siRNA_(439))、73%(siRNA_(312))、67%(siRNA_(1495))和33%(siRNA_(2062)).③ siRNA_(439)干扰小胶质细胞48 h后TLR4蛋白表达低(P<0.01).④ Lipofectamine~(TM) 2000 1 μl复合低于40 nmol·L~(-1)的siRNA的各组细胞存活率均在85%以上.结论 ① siRNA_(439)对小胶质细胞上TLR4表达的抑制效果大.② siRNA浓度40 nmol·L~(-1),Lipofectamine~(TM) 2000浓度1 μl,细胞毒性很低,适合转染.
