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基于生物信息学分析微小隐孢子虫含WD40结构域的蛋白功能
目的 对微小隐孢子虫中含WD40结构域的蛋白进行生物信息学分析,分析该蛋白家族的WD40结构并预测其功能,为微小隐孢子虫基因功能的研究提供一定的基础理论.方法 通过隐孢子虫基因组数据库收集数据,获得微小隐孢子虫含WD40结构域蛋白家族的序列信息,搜索每个蛋白的CDD结构域并进行NCBI BLAST比对分析,确定为WD40结构域家族蛋白,分析结构域并预测功能.结果 在C.parvum Iowa Ⅱ中共搜索到50个含有WD40结构域的蛋白,其中cgd1_1930、cgd5_740和cgd4_3360含有CAF1C_H4-bd超家族结构,可能参与DNA修复和DNA复制过程;cgd4_260含有ACE1-Sec16-like超家族,可能参与囊泡的形成和物质运输;cgd1_2600含有TAF5 NTD2结构域,可能参与蛋白与蛋白的相互作用.结论 在微小隐孢子虫中,WD40蛋白家族不仅可能单独发挥作用,而且还能通过相互辅助、结合发挥其生物效应.
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日本血吸虫信号通路相关基因SjWD101的生物信息学分析及其克隆与表达
目的 利用生物信息学方法分析日本血吸虫SjWD101的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆和表达,获得相应的重组蛋白.方法 从日本血吸虫GenBank数据库中筛选WD家族蛋白中全长基因,用相关软件进行生物信息学预测.通过RT-PCR扩增出全长编码区序列,克隆到表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,表达产物用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blotting)鉴定.结果 SjWD101是一个全长1085bp的基因,编码区为66～950,编码294个氨基酸,软件分析表明其理论分子量和等电点分别是31819.7Da和6.44.亚细胞定位分析表明该蛋白是胞浆蛋白,理化性质较稳定.二级结构以反向平行的β折叠为主.含有6个WD40结构域,属于WD蛋白家族中的一员,具有GTP结合蛋白的结构特征.经PCR、双酶切和测序证实pET-28a(+)-SjWD101构建成功.SDS-PAGE和Western blotting证实重组菌成功表达出融合蛋白,经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实WD101重组蛋白能被感染日本血吸虫的兔血清识别.结论 日本血吸虫WD101经生物信息学预测为WD家族蛋白,可能在血吸虫信号转导通路方面有其一定作用,本研究获得了纯化的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
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PER1与RACK1蛋白作用位点分析
目的 筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域.方法 采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用.结果 酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1 (WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用.结论 RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的小区域位于Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位.
