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猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立
目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法.方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测.结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%.猪的内脏器管中PCMV含量高为扁桃体,低的为小肠.结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义.
关键词： 猪巨细胞病毒 实时荧光定量PCR TaqMan荧光探针 检测 应用 -
柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT - PCR检测方法的建立
目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3( Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT - PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法.方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β- actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18 -T - CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT - PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果:建立的方法在1.0×101 ～ 1.0×108 copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2＞0.999),扩增效率高于98.0％,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品.用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101 copies.结论:建立的荧光定量RT- PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据.
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TaqMan荧光探针技术检测不同血清型B群链球菌的方法建立及评价
目的 建立基于T aqM an荧光探针技术,对不同血清型B群链球菌(GBS)鉴定的分子方法,为后续研究多重荧光探针技术检测不同血清型GBS奠定基础.方法 根据不同血清型荚膜多糖(CPS)序列的差异设计引物和探针,用实时荧光定量PCR扩增CPS序列,建立不同血清型的GBS分型方法,从灵敏度、特异度及临床分离株检测等方面对该方法进行评价,并与胶乳凝集试验结果比较.结果 同一血清型GBS的DN A 的对数浓度与循环阈值(Ct)呈良好的线性相关,该方法的检测下限均为1 pg/μL,一种探针只能检测对应血清型的GBS.10株标准菌株的T aqM an荧光探针技术检测结果与胶乳凝集试验结果一致.结论 T aqM an荧光探针技术是一种简单、快速、具有较高灵敏度和特异度的检测GBS血清型的方法,对临床分离株的分型优于乳胶凝集试验.
关键词： TaqMan荧光探针 实时荧光定量聚合酶链反应 B群链球菌
