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基于DPO引物特异性检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR方法
目的 引入一种设计简易、特异性强、退火温度范围宽的双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)设计,建立基于DPO引物特异性检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR方法.方法 以小肠结肠炎耶尔森氏菌16S 23SrRNA基因为靶基因,设计一对DPO引物,经过PCR反应体系优化,建立小肠结肠炎耶尔森氏菌DPO-PCR检测方法.测定了检测灵敏度,以常规PCR方法作为参照,分析DP&PCR方法的特异性及退火温度.结果 建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌DPO-PCR检测方法的灵敏度为1.43×102 CFU/mL;与常规PCR方法相比,DP&PCR方法在49～69℃退火温度范围内均能保持高效率扩增;特异性强,所测试17种病原菌中,仅小肠结肠炎耶尔森氏菌为阳性结果,且无非特异性扩增.结论 DPO-PCR方法不需要对引物参数特别是退火温度进行优化,特异性强,为致病微生物的快速准确检测提供了新方法.
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实时荧光定量PCR检测五日热巴通体
目的采用TaqMan-MGB探针建立检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)方法.方法根据五日热巴通体特异的16-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的16-23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板,建立了检测五日热巴通体实时荧光定量检测方法.结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度约为它的200倍.用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌,检出结果为阴性.实时荧光定量PCR检测五日热巴通体实验感染小鼠血、脾脏、肝脏和肺组织DNA样本,脾脏和肝脏样本中检出较高水平五日热巴通体DNA,血和肺部检出的目的DNA的水平较低. 结论本研究建立的检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR法具有很高的检测灵敏度和特异性,可用于临床患者血样本的检测,作五日热的早期诊断.
关键词： 五日热巴通体 实时定量PCR 16S-23S rRNA 巴通体感染 -
分支杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析
目的建立鉴定分支杆菌分离株的16S-23S rDNA 转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析的方法,用该方法对临床分离株进行鉴定.方法对从重庆某医院分离的29株分支杆菌菌株分别进行了PCR扩增,得到它们的16S-23S rDNA ITS片段,并测定所得到片段的DNA序列.用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较,计算种间相似性,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树,对分离株进行鉴定.结果在ITS序列分析中,有10株的序列分别与结核分支杆菌复合群(Mycobacterium tuberc ulosis complex, MTC)、戈登分支杆菌,脓肿分支杆菌的序列完全一致. 依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种;4株16S rDNA序列分析不能准确鉴定的分离株中其中3株(M4、M5、M12)鉴定为戈登分支杆菌,1株(M23)鉴定为脓肿分支杆菌.部分分离株的的ITS序列在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列,这些不同的序列之间的相似程度为27.1%～99.2%.用临床分离株的ITS序列与其相似的已知分支杆菌的ITS序列构建的系统发育树,菌株分群与16S rDNA序列构建的系统发育树的分群基本一致.结论分支杆菌的16S-23S rDNA ITS序列比16S rDNA序列有更大的多样性,该序列分析可作为16S rDNA序列分析鉴定分支杆菌的一种补充.
关键词： 分支杆菌 菌株鉴定 PCR 16S-23S rRNA DNA序列 -
54株分枝杆菌国际标准株16S-23S rRNA转录间隔区序列分析
目的 分析54株分枝杆菌国际标准株16S-23S rRNA转录间隔区(ITS)序列,为临床分离株的鉴定提供参考.方法 用16S-23S rRNA ITS序列分析法对54株分枝杆菌国际标准株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比.结果 除灰尘与微黄分枝杆菌;田野与千田分枝杆菌;抗热与副偶然分枝杆菌,奥布与母牛结核分枝杆菌;杜氏与猪分枝杆菌;金色与东海分枝杆菌,海与溃疡分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌;2株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌的16S-23S rRNA ITS序列完全相同无法鉴别外,其他各分枝杆菌菌种间16S-23S rRNA ITS序列均不相同,可以得到很好的鉴别.结论 16S-23S rRNA ITS序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际标准株16S-23S rRNA ITS序列的研究弥补了基因数据库的不足.
关键词： 分枝杆菌 16S-23S rRNA 转录间隔区 国际标准株 基因数据库
