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重组质粒pVAX1-Hsp70/CD80DNA疫苗体内外表达
目的 构建pVAX1-Hsp70/CD80质粒,观察其在体内外的表达,初步评估其有效性和安全性.方法 HindⅢ和XbaⅠ酶切质粒pcDNA3.1-Hsp70/CD80和载体pVAX1,将目的基因Hsp70/CD80定向连接入pVAX1中,鉴定构建的质粒pVAX1-Hsp70/CD8.将pVAX1-Hsp70/CD80质粒转染人胚肾293T细胞,Western blot法检测在转染细胞中Hsp70和CD80蛋白瞬时和稳定表达情况.用100μg pVAX1-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗免疫小鼠后,于第7天、15天、30天和180天用RT-PCR方法观察Hsp70和CD80在各组织中表达,Real time PCR检测IFN-γ和IL-4在脾脏中的表达.结果 经酶切和测序鉴定,重组质粒构建成功.转染24、48和72 h后的细胞以及G418筛选的稳定表达细胞株均有Hsp70和CD80的表达.第7天和第15天肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾和胸腺组织均有Hsp70和CD80表达.第30天肌肉、肺和肝有Hsp70表达.第180天均未检测出Hsp70和CD80表达.第7天和第15天IFN-γ有较高水平表达.结论 成功构建了pVAX1-Hsp70/CD80质粒,该重组质粒在一定时间内能高效表达Hsp70和CD80,并能诱导IFN-γ较高表达.
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抗肿瘤免疫基因治疗剂pVAX-IL-12-GB的构建及体内外表达验证
目的 构建能够同时表达人免疫调节因子IL-12,GM-CSF和B7.1的新型抗肿瘤免疫基因治疗剂pVAX-1L- 12-GB,验证以上免疫调节因子基因在293T细胞的表达以及IL-12基因在活体内的表达.方法 将人1L-12基因克隆到早期构建好的pVAX-IRES-GM-CSF-B7.1真核表达质粒的上游,将其构建成为pVAX-IL-12-GB重组质粒:利用脂质体法瞬时转染293T细胞,RT-PCR检测IL-12和GM-CSF-B7,1基因的转录,ELISA法检测细胞上清中上游IL-12基因和下游GM-CSF基因的蛋白表达,流式细胞术及免疫荧光检测下游B7.1基因的表达；利用电穿孔方法递送质粒进入小鼠股四头肌,免疫组化法检测IL-12基因在小鼠活体内的表达情况.结果 双酶切以及PCR鉴定获得的片段均与预期的片段大小一致,测序分析证实IL-12基因序列完全正确；瞬时转染293T细胞后,分别验证了人IL-12,GM-CSF和B7.1基因的mRNA转录和蛋白表达；电穿孔递送质粒后,活体肌肉组织内同样可以检测到IL-12基因的表达.结论 成功构建了可以同时表达人IL-12,GM-CSF和B7.1的新型抗肿瘤免疫基因治疗剂,为下一步开展肿瘤免疫基因治疗研究奠定了坚实的基础.
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可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达
目的 构建以塞姆利基森林病毒复制子载体为基础的可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,验证其在人胚肾293T细胞及免疫小鼠肌肉组织内的表达情况.方法 首先用NheI酶切既往构建的pVAX1-2PFcGB重组质粒,补平酶切后的粘末端,然后再用限制性内切酶BssHII继续酶切该线性化质粒,补平粘末端后即获得含有编码Surivin及hCGB-CTP37肿瘤抗原的融合基因片段2PFcGB,接着利用DNA重组技术将该片段克隆人基于塞姆利基森林病毒复制子载体改造的PSCK载体,筛选阳性重组质粒.接着,利用阳离子脂质体介导法将其瞬时转染入人胚肾293T细胞,利用流式细胞术及免疫荧光法检测融合抗原在293T细胞中的表达;利用电脉冲基因导入仪将该重组质粒递送至BALB/C小鼠股四头肌,利用免疫组化法验证肿瘤抗原在小鼠体内的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致,流式细胞术检测该重组质粒瞬时转染的293T细胞,可见大量的阳性荧光细胞,其IRES序列上游融合肿瘤抗原分子阳性表达率为5.70%,下游佐剂分子阳性表达率为19.75%;同时,利用两种肿瘤抗原特异抗体在免疫小鼠股四头肌组织切片上均检测到了相应表达.结论 成功构建了可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,该重组质粒在体内外均能高效表达外源肿瘤抗原及佐剂分子,这些结果为该抗肿瘤DNA疫苗进一步的抑瘤活性及免疫学作用机制的研究奠定了坚实的实验基础.
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复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用
目的 为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc.方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc；化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达；利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达.结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致.流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达；同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达.结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础.
