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短发夹RNA抑制外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达
目的:构建含荧光素酶(1uciferase,luc)基因的短发夹状RNA(shorr hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其在肝癌细胞Bel-7402中抑制外源荧光素酶的表达.方法:设计的两条反向重复的多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-luc重组质粒,与荧光素酶基因表达质粒pCMV-luc共转染肝癌细胞株BEL-7402,检测其对荧光素酶表达的影响.结果:PCR和DNA序列分析证实了重组质粒构建成功.pshRNA-luc对共转染的pCMV-luc中的荧光素酶具有明显的抑制作用,抑制率可达86%(P＜0.01).结论:构建的pshRNA-luc表达质粒能有效地抑制荧光素酶在肝癌细胞中的表达,为RNA干扰用于肿瘤的基因治疗打下基础.
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不同方式递送质粒DNA诱导体内表达效果的实验研究
目的 比较不同途径递送质粒DNA至Balb/c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果.方法 将编码荧光素酶(luc+)蛋白的重组质粒(pGL-3-CMV)或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部(2μg质粒DNM4.5Mpa/枪).于质粒注入后24～144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性.结果 肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠.基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值.结论 电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法.
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Prss37基因转录起始位点的确定及其转录调控的初步探讨
目的 确定Prss37基因的转录起始位点,并利用转基因技术在整体水平验证该启动子的组织特异性.方法 运用cDNA 5'末端快速扩增法(5' RACE)对C57BL/6J小鼠睾丸mRNA进行分析,确定Prss37的转录起始位点;构建Prss37内源启动子区域转录起始位点上游不同长度DNA片段(1 kb、2 kb、4 kb)驱动的荧光素酶基因表达的质粒;通过受精卵雄原核显微注射技术获得上述三种启动子驱动荧光素酶基因表达的转基因小鼠;利用活体成像技术观察荧光素酶基因的表达,明确启动子的组织特异性.结果 Prss37基因的转录起始位点位于NCBI GeneBankTM(NM_026317.2)报道序列上游的40 bp处;成功获得三种转基因小鼠,其中1kb启动子驱动的转基因小鼠检测到荧光素酶基因的表达,且在脑、睾丸和附睾组织中的表达较强.结论 明确Prss37的转录起始位点,成功获得了睾丸和附睾表达荧光素酶基因的转基因小鼠,为进一步的Prss37基因转录调控研究奠定了基础.
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阳离子脂质体介导的虫荧光素酶基因表达
目的研究阳离子脂质体Lipofectin介导虫荧光素酶基因在不同细胞株中的表达.方法质粒pDR2luc在大肠杆菌DH5α中扩增后用碱裂解法提取,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析,通过凝胶电泳及紫外分光光度计分析纯度、定量,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、人肾癌细胞株GRC及非洲绿猴肾细胞COS7,然后以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性.结果荧光素酶活性在4种细胞株中均有表达,且均有显著性差异(均P＜0.05).结论阳离子脂质体Lipofectin可用于多种真核细胞基因转染.
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阳离子脂质体介导的虫荧光素酶基因表达
目的研究阳离子脂质体Lipofectin介导虫荧光素酶基因在不同细胞株中的表达.方法质粒pDR2luc在大肠杆菌DH5α中扩增后用碱裂解法提取,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析,通过凝胶电泳及紫外分光光度计分析纯度、定量,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、人肾癌细胞株GRC及非洲绿猴肾细胞COS7,然后以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性.结果荧光素酶活性在4种细胞株中均有表达,且均有显著性差异(均P＜0.05).结论阳离子脂质体Lipofectin可用于多种真核细胞基因转染.
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杜氏盐藻荧光素酶基因表达载体的构建
目的:构建盐藻荧光素酶基因表达载体.方法:分别用合适的限制性内切酶消化载体pGL3-Enhancervector、pD-B、pMD-CA和pMD-rbcs,胶回收适当的片段,T4 DNA连接酶过夜连接,转化宿主菌大肠杆菌JM109.挑取阳性克隆,提取质粒DNA,酶切鉴定.结果:得到含盐藻自身启动子碳酸酐酶(CA)基因启动子、双倍重复碳酸酐酶(DCA)基因启动子和来自衣藻的1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(rbcs)基因启动子,以及荧光素酶(Luc)基因为外源基因的3个盐藻表达载体.结论:构建了3个杜氏盐藻荧光素酶表达载体.
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复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用
目的 为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc.方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc；化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达；利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达.结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致.流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达；同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达.结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础.
