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RNAi下调STAT3基因表达促进Bel-7402肝癌细胞凋亡
目的 探讨JAK/STAT3信号转导途径对肝癌细胞凋亡的影响.方法 以BEL-7402肝癌细胞为模型,采用RNAi技术,将STAT3-siRNA转染BEL-7402肝癌细胞,沉默STAT3基因表达,另设细胞对照组,阴性质粒组(pGCsi.U6/neoRFP scramble-siRNA载体转染BEL-7402).分别通过流式细胞术检测细胞凋亡比率的变化,JC-1荧光染色观察线粒体膜电势Δψm变化,并利用Western Blot方法检测Caspase 3蛋白质水平的变化.结果 STAT3-siRNA组凋亡率为(38.82 ±0.88)％,明显高于其他组[对照组(9.22±0.38)％,阴性质粒组(16.47±1.04)％,P＜0.05],并引起细胞线粒体膜电势明显降低[(59.06±1.89)％vs(91.33±1.78)％和(89.90±1.92)％,P＜0.05],活性Caspase 3蛋白在STAT3-siRNA组表达明显高于其他组(0.48±0.05 vs 0.22±0.04和0.26 ±0.06,P＜ 0.05).结论 RNAi沉默STAT3基因,抑制JAK/STAT3信号转导途径,促进BEL-7402肝癌细胞凋亡.
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SHH基因转染BMMSC心肌移植对大鼠心肌梗死后血管新生的影响
目的 探讨SHH(Sonic hedgehog)基因转染的骨髓间充质干细胞(BMMSCSHH)移植对大鼠心肌梗死区移植部位血管再生的影响.方法 密度梯度离心法及贴壁培养获得BMMSC后,电转染法将SHH基因转入骨髓间充质干细胞.以结扎法制备大鼠急性心肌梗死模型,将实验动物200只大鼠按随机数字表法分5组,每组40只;分别在梗死与正常交界部位移植BMMSCSHH(转染组)、等量的BMMSC(细胞组)、pcDNA3.1-Shh DNA(基因组)、BMMSC和pcDNA3.1-Shh DNA的混合物(混合组)、等容积的低糖DMEM培养基(对照组).于移植后第8周取正常心肌与心肌梗死交界区组织标本行免疫组化染色标记血管,通过血管密度分析法分析各组间交界区血管密度差异.结果 经CD34免疫组化染色后行血管密度分析显示:转染组(36.48±5.22)较对照组(16.71±3.41)血管密度增加(P＜0.01);较细胞组(29.46±2.27)、基因组(28.78±2.91)及混合组(29.55±4.55)血管密度增加(P＜0.05).结论 BMMSCSHH移植能有效表达目的 基因、促进心肌梗死后血管新生,为缺血性心脏病的细胞转基因治疗提供理论依据.
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SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 探讨SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的可行性.方法 利用电转法将SHH基因转染人大鼠骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察转染效率；分别绘制未转染及转染SHH基因后细胞生长曲线,观察转染对细胞的影响；采用PCR、RT-PCR、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞中外源性SHH基因的表达情况.结果 生长曲线显示转染后骨髓间充质干细胞生长曲线指数生长期及平台期延后,在转染后第12天与未转染达到一致.转染后48 h(即将用于移植前),经荧光倒置显微镜观察转染效率为30％,PCR检测转染后骨髓间充质干细胞中SHH表达较未转染细胞明显升高,实时定量PCR检测其升高约7倍左右,通过Western-blot检测转染后SHH蛋白产物表达明显升高.结论 电转法能够有效将外源性SHH基因转染人大鼠MSC并能获得有效表达,为进一步大鼠缺血性心脏病模型的在体基因治疗提供了前提基础.
