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线粒体在心肌缺血再灌注损伤与保护中的重要作用
目的:心肌梗死后及时再灌注是挽救缺血心肌必需的步骤,但该过程伴随着再灌注损伤。缺血/再灌注( I/R)造成的线粒体Ca2+([Ca2+]m)超载、活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)大量释放以及线粒体膜通透性通道(mitochondrial permeability transition pore, MPTP),并导致线粒体严重的结构和功能破坏,是心肌细胞I/R损伤的主要原因。因此寻找保护线粒体的关键靶点,对于深入理解I/R导致心肌细胞结构和功能损伤机制,进而提出心肌保护的新策略至关重要。本实验旨在探讨多种心肌保护措施对I/R心肌的线粒体保护作用及其机制。方法:利用大鼠离体心脏全心I/R模型和成体心肌细胞模拟I/R模型,结合基因的遗传学操作,探讨间歇性低压低氧( intermittent hypobaric hypoxia, IHH)和过氧化氢预处理( hydrogen peroxide pre-conditioning, H2 O2 PC)对心肌线粒体的保护作用。利用Rhod-2、MitoSOX和TMRE 荧光染料分别实时监测线粒体[ Ca2+] m 超载、线粒体ROS的释放和线粒体膜电位( mitochondrial membrane potential,ΔΨm )的变化。分离缺血前和再灌注后活体心肌组织的线粒体,检测线粒体膜电位、耗氧率、ROS释放量及三磷酸腺苷( adenosine triphosphate, ATP)合成酶活性。结果:IHH可以通过ROS降低[ Ca2+] m 超载,改善心肌I/R损伤后线粒体的膜电位、耗氧率、ATP合成酶活性及心肌ATP含量的降低,进而改善心肌I/R后心功能,减少心肌梗死面积。此外,H2 O2 PC在I/R过程中通过UCP3降低[ Ca2+] m 超载及防止ΔΨm 丧失,进而改善心肌I/R后心功能,减少心肌梗死面积。本研究揭示了线粒体在心肌I/R损伤和保护中的重要地位和调控机制,为解释IHH和H2 O2 PC心肌保护作用的机理提供新视角,并为缺血性心脏病的临床治疗提供新的实验证据。
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PDE5巯基亚硝基化增加其泛素-蛋白酶体途径依赖的降解
目的:研究一氧化氮介导的巯基亚硝基化(S-nitrosylation)对磷酸二酯酶5(PDE5)蛋白稳定性的影响,阐明衰竭心脏中PDE5表达增加的分子机制。方法:采用质谱分析和点突变的手段,检测PDE5发生S-nitrosylation的位点。采用Western blot的方法检测一氧化氮和过氧化氢对细胞PDE5表达的变化。结果:在细胞和动物模型中均可以检测到PDE5发生S-nitrosyla-tion,这种修饰发生在第220位的半胱氨酸残基上。发生S-nitrosylation修饰后,PDE5的活力降低20%左右,并很快被泛素-蛋白酶体系降解,引起细胞内PDE5的表达上调。突变第220位半胱氨酸残基、过氧化氢预处理以及抑制sGC和PKG活力均可以抑制一氧化氮引起的PDE5表达下调。突变PDE5的磷酸化位点也有类似效果。反过来,在心肌细胞中抑制一氧化氮合酶( NOS)活力或敲除NOS3均可以提高PDE5的表达。结论:S-nitrosylation能够引起PDE5的降解,而衰竭心脏中一氧化氮生物利用率的降低可能是导致PDE5表达增加的主要原因。