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人水甘油通道蛋白9重组质粒的构建及表达
目的:构建人水甘油通道蛋白9(aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明AQP9在非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的作用奠定基础.方法:通过RT-PCR方法从人肝脏组织中获得AQP9基因,插入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9,转染COS-7细胞,通过荧光显微镜检测其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9在真核细胞中的表达.结果:PCR及酶切鉴定显示插入人AQP9大小正确.测序鉴定显示,1个碱基发生突变,45位:A→G,为无义突变.通过RT-PCR和Western blot检测到AQP9表达,说明AQP9基因在COS-7细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合,且具有免疫原性.结论:成功构建了pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步研究AQP9在NAFLD发生发展中的作用奠定基础.
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重组AQP9对L-02细胞脂质沉积的影响
目的 构建人水甘油通道蛋白9( aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,验证其在L-02肝细胞中的表达,并检测其对非酒精性脂肪肝病( nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型的作用.方法 从人肝脏组织中提取总RNA,RT-PCR获得AQP9基因,克隆到载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9.将其转染L-02细胞,通过荧光显微镜观察其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9基因在细胞中的表达.通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测其对L-02细胞脂肪变性模型的作用.结果 成功构建pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并能在L-02细胞中表达,将其转染L-02细胞脂肪变性模型后,油红O染色可见油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组较油酸组细胞内脂质含量明显升高,油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(5.435±0.337)、(2.016±0.144)、(1.485 ±0.113) mmol/L,而油酸组分别为(3.218 ±0.220)、(1.538±0.193)、(1.024±0.148) mmol/L,两者之间差异有统计学意义(P＜0.01),说明上调AQP9表达量可使其脂肪变性程度加重.结论 AQP9异常升高能够引起或加重非酒精性脂肪肝病.
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泽泻汤加味方对高脂血症大鼠肝细胞水甘油通道蛋白9表达的影响
目的:通过研究泽泻汤加味方对高脂血癌大鼠肝细胞水甘油通道蛋白9(AQP9)表达的影响,探讨其防治高脂血症的作用机制.方法:将60只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、辛伐他汀1.89mg/kg组和泽泻汤加味方7.39、14.78、29.56g/kg组,采用喂饲高脂饲料的方法复制高脂血症模型,造模的同时给予相应药物治疗.治疗5周后检测大鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量、观察肝组织形态学变化,并运用RT-PCR及Western Blot法检测肝细胞AQP9基因、蛋白的表达变化.结果:模型组大鼠血清中TG、TC、LDL-C的含量及肝细胞中AQP9表达升高,HDL-C含量显著降低,肝组织出现脂肪变性;泽泻汤加味方29.56g/kg、14.78g/kg、7.39g/kg组和辛伐他汀1.89mg/kg组大鼠血脂中TG、TC、LDL-C的含量及肝细胞AQP9的表达均显著降低,HDL-C含量显著升高,肝组织的形态结构亦趋于正常.结论:泽泻汤加味方具有较好的调节血脂作用,推测该方通过下调肝细胞AQP9的表达、抑制甘油的渗透、减少TG的合成,是防治高脂血症的作用机制之一.
