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肠出血性大肠埃希菌O157:H7 tccP基因敲除菌株的构建
目的 构建肠出血性大肠埃希菌O157:H7介导和宿主细胞的粘附与擦拭(A/E)损伤相关基因tccP敲除菌株.方法 根据GenBank公布的肠出血性大肠埃希菌O157:H7基因序列,设计PCR引物,分别扩增克隆tccP基因两端外侧的DNA片段,并与氯霉素耐药基因Cam连接后亚克隆于pBluescriptSK Ⅱ质粒,通过同源重组替换野生型tccP基因,采用PCR、RT-PCR以及Western blot分别从DNA、RNA及蛋白质水平鉴定tccP基因是否被敲出.结果 在DNA、RNA及蛋白质3个水平均证实Cam片段已成功替换tccP基因而整合进入O157:H7基因组中.结论 成功构建肠出血性大肠埃希菌O157:H7 tccP基因敲除菌株.
关键词： 肠出血性大肠埃希菌O157:H7 tccP 同源重组 基因敲除 -
肠出血性大肠埃希菌O157:H7TCCP蛋白与宿主细胞IRTKS蛋白的相互作用
目的 通过体外结合实验验证EHEC O157:H7内膜素受体偶联细胞骨架蛋白重复片段与人肠上皮细胞IRTKS蛋白SH3结构域之间的相互作用,并制备二者蛋门复合体,为利用晶体学方法研究其相互作用奠定基础.方法 将IRTKS蛋白的SH3结构域cDNA序列克隆至pET30a表达质粒,转化BL21(DE3),诱导表达纯化SH3(IRTKS)蛋白;制备TCCP重复片段TC-CP(3R)蛋白;将SH3(IRTKS)与TCCP(3R)按照不同比例混合后,非变性丙烯酰胺凝胶电泳鉴定两者相互结合后产物;利用分子筛层析收集标准蛋白、TCCP(3R)、SH3(IRTKS)和TCCP(3R)-SH3(IRTKS)复合体的出峰体积,回归计算复合物的分子量,分析蛋白相互结合的比例.结果 成功克隆表达了SH3(IRTKS)重组质粒;并制备了高纯度的SH3(IRTKS)和TCCP(3R)蛋白;非变性丙烯酰胺凝胶电泳结果证实TCCP(3R)与SH3(IRTKS)发生相互作用形成了蛋白质复合体;复合体的分子量约为33 000,二者相瓦结合的比例约为1:1.结论 本研究为TCCP重复片段与SH3(IRTKS)相互作用提供了直接证据,同时复合体的制备,为利用晶体学研究两者的相互作用奠定了基础.
关键词： EHEC O157:H7 tccP IRTKS 重组表达 蛋白质复合体 -
肠出血性大肠杆菌0157:H7 TCCP蛋白研究进展
TCCP(内膜素受体偶联细胞骨架蛋白,Tir couple cytoskeleton protein)是近年研究新发现的EHEC(肠出血性大肠杆菌)0157:H7致病分子,它经大肠杆菌Ⅲ型分泌系统转导人宿主细胞内,结合并活化宿主蛋白N-WASP(神经威奥综合症蛋白),引起肌动蛋白的聚集,终诱导特征病理改变黏附、擦拭(A/E)损伤的形成.本文就近年来对它的研究情况作一简要综述.
关键词： 肠出血性大肠杆菌0157 H7 tccP 黏附与擦拭损伤
