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安徽省114株EHEC O157:H7菌株毒力因子基因的初步分析
目的对安徽省近几年分离的肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)菌株的毒力因子基因进行实验室检测,以分析和研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的毒力特征和致病特性.方法采用聚合酶链反应(PCR)检测EHEC O157:H7的两种重要的毒力因子志贺样毒素(SLT)和溶血素(hly)的特异性基因片段,并辅以血清学试验、生化试验进行菌株的生物学特性鉴定.结果和结论检测结果显示,有63.2%的EHEC O157:H7菌株携带SLT、hly基因,动物源的菌株以家禽较高,家畜次之,3株源自腹泻病人的菌株毒力因子基因携带率为33.3%,说明分离的EHEC O157:H7菌株具有较强的致病性;114株菌株中,有14.0%的菌株在24h内发酵山梨醇,发酵山梨醇菌株的毒力因子基因携带率18.8%,显著低于不发酵菌株的70.4%,显示出山梨醇发酵特性变异与毒力因子基因缺失之间具有一定的关联性.
关键词： EHEC O157:H7 志贺毒素 溶血素 基因 聚合酶链反应 -
肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达
目的通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA蛋白,并分析其免疫学性质.方法采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)载体上,转化宿主细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,同时分析其N端氨基酸序列,免疫家兔鉴定其抗原性.结果重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同,一致性为99.83%,所编码的氨基酸序列没有改变.重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约30%.免疫家兔所得抗体滴度为1:32.结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a(+)-espA,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为进一步制备亚单位疫苗奠定基础.
关键词： EHEC O157:H7 espA基因表达 DNA重组 -
肠出血性大肠杆菌O157:H7(浙江株)的细胞毒性作用及其意义探讨
目的 用Vero、HeLa、CHO及KMB17细胞测定EHEC O157:H7首例浙江株97-1-68菌株的细胞毒性,同时与其他菌株作比较.方法 采用微量组织培养板的单层细胞培养测定菌体超声裂解液及细菌培养上清液的细胞毒性作用效价.结果 97-1-68菌株对全部4株细胞均无细胞毒性作用,而阳性对照株对Vero、HeLa细胞具有较强的细胞毒性作用.结论 本文提出在EHEC O157:H7感染中可能存在流行株和非流行株的"两类菌株"的观点.
关键词： EHEC O157:H7 细胞毒性 志贺样毒素 -
交叉引物等温扩增技术在肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用
目的 建立一种快速、敏感、特异的肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157∶H7的交叉引物等温扩增(Cross Priming Amplification,CPA)检测方法.方法 根据EHEC O157∶H7 stx1基因特征性保守序列(GenBank83460),设计交叉引物、剥离引物和检测探针,建立了EHEC O157∶H7的CPA检测技术.用该方法检测19株细菌常见的食源性细菌,以验证其特异性;并用菌液浓度梯度稀释的方法对该方法的检测灵敏度进行评价.并通过60份食品模拟样品验证其在实际应用中的可性行,该检测结果与经典的细菌分离培养鉴定方法及常用的荧光定量PCR法进行比较.结果 在检测的19株细菌中,只有EHEC O157∶H7菌株的检测结果为阳性.其它菌株检测结果均为阴性,证明其特异性良好;通过浓度梯度稀释证明该方法检测的灵敏度可达l02 cfu/mL;与分离培养鉴定法及荧光定量PCR法比较,其检测的灵敏度均为96.77％和96.67％、特异度分别为93.10％和90％、准确性分别为95％和93.33％.结论 用于EHEC O157∶H7的CPA检测体系具有简便、快速、灵敏、特异的优点,可用于进出境口岸现场及食品EHEC O157∶H7的快速检测.
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大肠埃希菌O157:H7在8种食品中存活力观察
目的探讨肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7在不同食品中的存活力.方法采用EHEC O157:H7933第5代菌株人工污染8种食品,染菌量为7log10 cfu/ml·g;对该菌在4、25℃条件下的存活力进行实验观察.结果EHEC O157:H7在全奶、奶粉、鱼肉香肠及猪肉松4种动物性食品中存活较长时间(70 d以上),且存活菌量呈先升后降的变化趋势,在2种温度条件下均能增殖1～2log10 cfu/(ml·g),到达高峰后呈对数衰减趋势,42 d后仍有3～6log10cfu/ml·g活菌量;在橙汁汽水和乳酸菌饮料中存活时间相对较短,分别为2～5 d和10～27 d,4℃橙汁汽水和25℃乳酸菌饮料在衰减至4log10 cfu/(ml·g)后急剧下降:在草莓酱和苹果酱中,两种温度条件下EHECO157:H7均呈间断性检出.结论 EHEC O157:H7在常见食品中的存活能力强.加强食品特别是动物性食品及饮料的卫生管理是预防和控制该菌感染的重要措施.
关键词： EHEC O157:H7 食品污染 存活率 -
O157:H7(浙江株)的细胞毒性作用及其意义探讨
目的用Vero、HeLa、CHO及KMB17细胞测定EHECO157:H7首例浙江株97-1-68菌株的细胞毒性,同时与其他菌株作比较.方法采用微量组织培养板的单层细胞培养测定菌体超声裂解液及细菌培养上清液的细胞毒性作用效价.结果97-1-68菌株对全部4株细胞均无细胞毒性作用,而阳性对照株对Vero、HeLa细胞具有较强的细胞毒性作用.结论在EHEC O157:H7感染中可能存在流行株和非流行株的“两类菌株”.
关键词： EHEC O157:H7 细胞毒性 志贺样毒素 -
肠出血性大肠杆菌O157:H7分子生物学检测
本文对肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的分子生物学检测方法(DNA探针、聚合酶链反应),以及O157:H7的流行菌株分析的研究进展作了综述.
关键词： EHEC O157:H7 DNA探针 聚合酶链反应 流行株分析 -
河南省肠出血性大肠杆菌(EHEC O157:H7)感染之流行与基因特征研究
目的:了解河南省肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic escherichia coli,EHEC)的流行状况与流行菌株的志贺毒素基因型.方法:采集河南省14个监测点上腹泻病人、家畜家禽粪便和肉食品等标本分离EHEC菌株.应用分子生物学技术检测EHEC菌株的rfbO157、rfbO111、hlyA、eaeA、stx2和stx1等毒力基因和志贺毒素基因亚型,应用细胞培养技术检测菌株Vero细胞毒性.结果:从腹泻病人、家畜家禽、肉食品、苍蝇、蜣螂中均分离出EHEC O157:H7菌株,波尔山羊的带菌率高达到29.8%.138株携带志贺毒素基因的菌株中,EHEC O157:H7计95株,占产毒菌株的68.8%;EHEC 非O157菌株43株,占31.2%.菌株可分为5种毒素基因型,EHEC O157:H7仅含stx2基因,以stx2vha亚型为主,不含有stx1基因.EHEC 非O157血清型毒素基因型较复杂.携带stx1和/或stx2的菌株均具有Vero细胞毒性.结论:河南省腹泻病人和家畜家禽中存在EHEC感染.EHEC O157:H7血清型是优势菌型,羊是主要宿主动物.目前河南省EHEC O157:H7菌株毒素基因型为stx2并以stx2vha亚型为主.
关键词： EHEC O157:H7 志贺毒素基因 基因特征 基因亚型 多重PCR -
醋酸对冻鸡分割品中EHEC O157:H7耐酸性影响的研究
目的 探讨醋酸对冻鸡分割品中EHEC O157:H7耐酸性的影响. 方法通过用2%醋酸对EHEC O157:H7污染的冻鸡进行喷洒、浸泡一定时间,然后在4℃和-25℃贮藏.研究EHEC O157:H7在喷洒和浸泡后的冻鸡分割品中对酸的耐受时间,抵抗酸性较强的EHEC O157:H7随着时间变化,观察其受酸影响的程度. 结果在处理受EHECO157:H7污染的冻鸡分割品时,增加2%醋酸的量和处理时间,并且及时将样品保存在-25℃,完全可以降低EHEC O157:H7对冻鸡分割品的污染程度. 结论在合理使用各种消毒措施的同时,采取这个对食品感宫和人体健康无害的方法,来预防和控制EHEC O157:H7对食品和环境的污染,是切实可行的.
关键词： 醋酸 冻鸡分割品 EHEC O157:H7 耐酸性 -
肠出血型大肠埃希菌O157：H7 ppk基因缺失株的构建及其生物学特性分析
目的：利用Red重组系统构建肠出血型大肠埃希菌（EHEC）O157：H7 ppk基因缺失株,并研究其生物特性。方法设计并合成一对同源臂引物，每条引物5'端与ppk基因同源，3'端与卡那霉素抗性基因同源，扩增卡那霉素抗性基因片段；制备含有pKD46质粒的EHEC O157：H7 EDL933w感受态细菌，然后将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中；利用pKD46介导的Red重组系统，通过同源重组替换EHEC O157：H7 EDL933w ppk基因，PCR和测序验证；通过革兰染色、测D600值、吉姆萨染色比较EHEC O157：H7 EDL933w野生株和突变株的形态结构、生长能力和黏附性。结果构建了ppk基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157：H7 EDL933w突变菌株（EHEC O157：H7 EDL933wΔppk），初步探索了EHEC O157：H7 EDL933w野生株和突变株的生物学特性。结论本研究运用Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157：H7 ppk基因缺失株，为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中ppk基因的调控机制奠定了基础。
关键词： EHEC O157:H7 ppk基因 Red重组系统 基因突变 -
肠出血性大肠埃希菌O157:H7TCCP蛋白与宿主细胞IRTKS蛋白的相互作用
目的 通过体外结合实验验证EHEC O157:H7内膜素受体偶联细胞骨架蛋白重复片段与人肠上皮细胞IRTKS蛋白SH3结构域之间的相互作用,并制备二者蛋门复合体,为利用晶体学方法研究其相互作用奠定基础.方法 将IRTKS蛋白的SH3结构域cDNA序列克隆至pET30a表达质粒,转化BL21(DE3),诱导表达纯化SH3(IRTKS)蛋白;制备TCCP重复片段TC-CP(3R)蛋白;将SH3(IRTKS)与TCCP(3R)按照不同比例混合后,非变性丙烯酰胺凝胶电泳鉴定两者相互结合后产物;利用分子筛层析收集标准蛋白、TCCP(3R)、SH3(IRTKS)和TCCP(3R)-SH3(IRTKS)复合体的出峰体积,回归计算复合物的分子量,分析蛋白相互结合的比例.结果 成功克隆表达了SH3(IRTKS)重组质粒;并制备了高纯度的SH3(IRTKS)和TCCP(3R)蛋白;非变性丙烯酰胺凝胶电泳结果证实TCCP(3R)与SH3(IRTKS)发生相互作用形成了蛋白质复合体;复合体的分子量约为33 000,二者相瓦结合的比例约为1:1.结论 本研究为TCCP重复片段与SH3(IRTKS)相互作用提供了直接证据,同时复合体的制备,为利用晶体学研究两者的相互作用奠定了基础.
关键词： EHEC O157:H7 tccP IRTKS 重组表达 蛋白质复合体
