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利用AlphaLISA技术建立版纳病毒IgG抗体检测方法
目的 建立检测版纳病毒(BAV)IgG抗体的AlphaLISA方法.方法 利用BAV重组VP9蛋白(GST-BAVVP9),以及制备的BAV兔抗血清和鼠抗血清,先将不同浓度的GST-BAV VP9和兔抗血清共同孵育,优化佳抗原、抗体浓度;再用鼠抗血清与之竞争,建立竞争法检测方法,并应用于50份云南省发热病人BAV IgG的检测.结果 当GST-BAV VP9和兔抗血清浓度为1 nmol/L和1∶5000时,结合力强并且可以被鼠抗血清竞争性抑制,即可用于BAVIgG的检测.利用建立的方法,在50份发热病人血清中检测到9份阳性.结论 建立了竞争性AlphaLISA方法,可用于BAV感染的筛查.
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辽宁省部分地区2006年虫媒病毒分离鉴定
目的 调查辽宁省虫媒病毒的种类及分布.方法 2006年8月在辽宁省沈阳市、营口市、盘锦市、锦州市和丹东市采集蚊虫标本,利用组织细胞培养分离病毒,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果 5个市共采集蚊虫标本5410只,分离到8株阳性分离物,经鉴定其中3株(LN0684、LN0688、LN0689)为版纳病毒,1株(LN0636)为甲病毒属盖塔病毒,另外4株尚在鉴定.新分离的版纳病毒与我国此前的分离株处于同一个进化簇,核苷酸同源性91.2%～94.7%.新分离的盖塔病毒与韩国分离株(swine)在一个进化枝上,核苷酸同源性为99.2%,与俄罗斯分离株、中国大陆分离株及台湾分离株的核苷酸同源性在95%～99%之间.结论 2006年在辽宁省分离到3株版纳病毒、1株盖塔病毒和4株未知虫媒病毒.版纳病毒、盖塔病毒为辽宁省首次分离;盖塔病毒核苷酸同源性和韩国分离株近.
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基于第12节段基因序列的版纳病毒分子遗传进化分析
目的 了解自1980-2012年在世界各地分离的版纳病毒分子遗传进化特征.方法 采用多种生物信息学分析方法,对1980-2012年我国及世界各地分离的版纳病毒进行基于第12节段基因序列的系统进化、分子溯源分析.结果 版纳病毒的共同进化祖先出现时间为315(95％HPD:63～ 619)年前,第12节段的进化速率为2.33×104(95％HPD:2.84×104～8.52×10-3)碱基替换/位点/年,提示版纳病毒属于新发快速进化的虫媒病毒.结论 版纳病毒属于快速进化的新发虫媒病毒,其地域分布范围进一步扩大且已经分化出新的病毒变种,应加强对该病毒在自然界分布及其致病性的监测.
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云南省一株版纳病毒的分离和鉴定
目的 对2008年在云南省勐腊县采集的蚊虫进行版纳病毒(BAV)分离和鉴定.方法 2008年7月在勐腊县南嘎村人房和畜圈采集蚊虫标本,用细胞培养法进行虫媒病毒分离并鉴定,测定分离到的BAV第5、8及11节段序列,利用MEGA4软件进行系统进化分析.结果 共采集到蚊虫7种1731只,分离到1株导致C6/36细胞产生规律病变的分离物,经血清学和分子生物学鉴定为BAV,系统进化分析显示第8节段和中国分离株关系近,而第11节段和越南分离株关系近.结论 系统进化分析提示该BAV毒株可能与越南分离株之间发生了基因重配.
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新发虫媒病毒:基因A型版纳病毒全基因组序列扩增引物
目的 设计版纳病毒型别特异性测序引物,为构建快速高效经济的版纳病毒全基因组测序平台奠定基础.方法 根据GenBank已知的版纳病毒基因序列信息进行基因型分析,采用Primer Premier v6.0及Oligo 7.56软件完成版纳病毒亚型特异性扩增引物的设计与评估.使用中国分离的30株版纳病毒进行版纳病毒型别特异性引物工作效率验证和评估.结果 通过对30株隶属于2个不同基因亚型的版纳病毒开展全基因组序列测定,获得2套型别工作效率高、扩增效果稳定的基因A型特异性版纳病毒全基因组序列扩增测序引物.基因A1亚型引物一套共26对;基因A2亚型引物一套共计30对.完成了30株版纳病毒全基因组序列扩增.结论 设计的版纳病毒型别特异性扩增测序引物可以高效准确地完成版纳病毒全基因组序列扩增,为进一步深入研究版纳病毒分子生物学特征奠定了基础.
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中华按蚊分离的版纳病毒全基因组序列测定与分子遗传进化分析
目的 对分离自中华按蚊的版纳病毒进行病毒全基因组核苷酸序列测定和分子遗传学分析.方法 使用分子病毒学方法测定病毒全基因组12节段核苷酸序列,以生物信息学软件进行序列比对、同源性和分子遗传进化分析.结果 2012年从云南省中缅边境地区中华按蚊分离的版纳病毒(YN 12234病毒株)能在C6/36细胞引起细胞病变并稳定传代,该病毒为12节段RNA病毒.根据病毒VP1蛋白(RdRp)氨基酸序列进行的分子遗传进化分析发现,YN 12234病毒属于呼肠孤病毒科东南亚12节段RNA病毒属版纳病毒.对第12节段基因序列的进一步分析显示,YN 12234病毒属于A2基因型版纳病毒.系统进化分析结果还显示,从中华按蚊分离的版纳病毒与此前从中华按蚊分离的版纳病毒处在不同进化分支,且不同蚊虫分离的版纳病毒并非聚类在共同的进化分支.结论 从中华按蚊分离的YN 12234病毒株属于含有12节段的版纳病毒,分子进化分析结果提示包括云南省分离的YN12234病毒在内的目前国内外从蚊虫分离的版纳病毒并不存在病毒与蚊虫种类之间的媒介适应性.
关键词： 版纳病毒 中华按蚊 东南亚12节段RNA病毒属 -
云南省东北等地区蚊虫及蚊媒病毒调查研究
目的 了解滇东北等地区蚊虫及蚊传虫媒病毒分布特点,为虫媒病毒病防治提供科学依据.方法 2009年在滇东北等地区的6个县采集蚊虫标本；蚊虫经分类鉴定后,用细胞培养法分离病毒,对病毒分离物进行分子生物学鉴定.结果 共采集到4属(库蚊、按蚊、阿蚊、伊蚊)24种18 562只蚊虫,其中三带喙库蚊、中华按蚊为主要蚊种,构成比分别为58.37％和28.45％；从蚊虫标本中分离到15株病毒,经分子生物学鉴定,其中2株(YN091l和YN0967)为基因Ⅰ型流行性乙型脑炎(乙脑)病毒,均分离自三带喙库蚊；1株(YN0922)为版纳病毒,分离自中华按蚊；12株为淡色库蚊浓核病毒,其中9株分离自三带喙库蚊,3株分离自中华按蚊.结论 三带喙库蚊和中华按蚊为调查地区的优势蚊种,并携带乙脑病毒、版纳病毒和淡色库蚊浓核病毒；滇东北地区首次分离到乙脑病毒.
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湖北省部分地区2009年蚊传虫媒病毒调查
目的 调查湖北省部分地区蚊传虫媒病毒种类和分布状况.方法 2009年夏季在湖北省黄冈市武穴市和咸宁市通城县采集蚊虫标本,用组织培养法分离病毒,用血清学和分子生物学方法对阳性病毒分离物进行鉴定,利用生物信息学软件对新分离病毒进行序列同源性和系统进化分析.结果 采集到3属5种9424只蚊虫标本,阳性4株(HBTC0913、HBTC0917、HBTC0919和HBTC0921),经血清学和分子生物学鉴定均为版纳病毒；版纳病毒第12节段分子进化分析显示,4株新分离版纳病毒与中国北京、云南和内蒙古地区以及越南的分离株处于同一亚群,而印度尼西亚分离株处于另外一个进化群中；新分离株与其他分离株相比,第12节段编码区核苷酸同源性为87.2％～89.8％,氨基酸同源性为86.1％～90.9％.结论 在湖北省分离到版纳病毒,与中国云南毒株YN6的进化关系较近.
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从滇西北地区首次分离到版纳病毒
目的 对滇西北地区分离的版纳病毒进行系统鉴定,明确与云南其他地区分离株的差异.方法 对2005、2006年从滇西北地区分离的3株版纳病毒进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,测定第12片段核苷酸序列,进行序列的同源性和系统进化分析.结果 从2005、2006年滇西北蚊虫标本中分离到的3株版纳病毒为直径约70 nm、无包膜、有双层衣壳的球形颗粒,基因组带型为6-6分布.3株版纳病毒问第12片段核苷酸序列同源性为99%,与云南其他地区和印度尼西亚版纳病毒毒株的大同源性分别为98%和90%;系统进化分析显示滇西北分离株和云南其他地区分离株共同形成一个分枝;第12片段编码的氨基酸序列比较发现我国版纳分离株和印度尼西亚毒株间存在共同的氨基酸残基差异.结论 首次从滇西北地区蚊虫中分离到3株版纳病毒,基因序列分析显示滇两北分离株和云南其他地区分离株同源性较高.
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甘肃省分离的版纳病毒具有显著地域特征
目的 对2007年在甘肃省平凉地区农村人房、猪舍和牛棚采集的蚊虫中分离的版纳病毒进行鉴定并对病毒基因组第12片段进行测序和分析.方法 2007年8月在平凉市采集蚊虫标本,对标本进行病毒分离并对分离物进行系统鉴定,测定分离到的版纳病毒第12片段序列,以软件进行病毒的序列比对、同源性和系统发生分析.结果 共采集到蚊虫标本2 926只,从中分离到11株致C6/36细胞产生规律病变的分离物,其中3株能引起BHK-21细胞病变.鉴定结果显示共分离到9株版纳病毒.RNA-PAGE结果显示9株版纳病毒基因组带型与对照株 BJ95-75的一致,但第6片段与对照相比稍小.新分离版纳病毒第12片段核苷酸序列同源性在99.5%～100%之间,与其他分离株的同源性为88.6%～97.6%(核苷酸)和85.5%～97.1%(氨基酸).基于版纳病毒第12片段核苷酸序列的系统发生分析显示,甘肃省分离株处于中国株进化支中的一个独立分支,与其它地区分离株具有明显的差异.结论 再次从甘肃省的蚊虫标本中分离到多株版纳病毒,基因序列和系统发生分析显示甘肃省分离株在进化上相对独立,具有显著的地域特征,可能属于版纳病毒中的一个新亚型.
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甘肃省天水及陇南部分地区虫媒病毒调查
目的 对甘肃省天水陇南部分地区的吸血蚊虫进行病毒分离与鉴定.方法 2006年8月在当地采集蚊虫标本,分离病毒和对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定,以软件进行病毒的核苷酸序列比对和系统发生分析.结果 分离到19株病毒,鉴定结果 显示分离株GS10-2为盖塔病毒,GS42-2为版纳病毒,其余分离株为一种基因组约8 000核苷酸的未知RNA病毒.盖塔病毒分离株3'UTR中具有与已往中国分离株相同的缺失序列和3个特异核苷酸位点.版纳病毒分离株基因组第12片段的进化关系同其它中国分离株有明显差异,位于一条独立的进化枝中.结论 在该地区分离到1株盖塔病毒、1株版纳病毒和17株未知RNA病毒;盖塔病毒与以往我国分离株的遗传关系密切,版纳病毒与我国其它地区分离株有明显差异,在进化上相对独立.
