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NT4-TAT-His-PR39融合基因cDNA的构建及意义
目的:探讨PR39对急性缺血心肌的保护作用,构建可分泌表达PR39的神经生长因子4(NT4)-TAT-His-PR39融合基因cDNA.方法:采用互为模板、引物的PCR技术,制备两端含有酶切位点的PR39 cDNA片段.通过常规分子生物学方法,将其与编码NT4信号肽及引导肽、TAT及6×His基因序列用T4 DNA连接酶相连,将NT4-TAT-His-PR39装入质粒pBV220中.结果:融合基因NT4-TAT-His-PR39的长度为421 bp,限制性内切酶切图谱显示,目的带的大小略超过marker的400 bp的位置,证实已经成功地将PR39 cDNA重组到NT4-TAT-His序列的下游.基因测序结果及DNAsis软件分析结果表明,NT4-TAT-His-PR39的全序列与实验设计的序列完全一致.结论:成功地构建能分泌表达PR39、并具穿膜功能和标签的融合基因NT4-TAT-His-PR39.
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NGAL蛋白Ni2+-金属鏊合层析纯化及其鉴定
背景与目的:通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2+-金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定,后获得一定丰度与纯度的NGAL蛋白.材料与方法:将pDsbA2.0-NGAL融合表达载体转化大肠杆菌,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物的产量与可溶性,然后将表达产物进行Ni2+-金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定.结果:将pDs-bA2.0-NGAL融合表达载体进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示表达的NGAL融合蛋白产量高、可溶性好;对表达的NGAL蛋白进行Ni2+-金属鏊合层析纯化后其纯度＞95%,MALDI-TOF-MS鉴定结果提示纯化后NGAL蛋白分子量与其理论分子量的误差仅为0.91‰.结论:通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2+-金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定,后确切获得了一定丰度电泳纯的NGAL蛋白,这为下一步制备其抗体奠定了良好的实验材料.
关键词： NGAL Ni2+-金属鏊合层析 6×His MALDI-TOF-MS
