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立克次体的16S rRNA基因序列分析
目的研究立克次体的16S rRNA基因序列的差异,为其分类和鉴定提供依据.方法从基因数据库中选择不同的立克次体属代表种的16S rRNA基因序列,在计算机上用多序列排列程序对序列进行同源位排列和对比分析,以及依据序列的相似程度构建进化树.结果立克次体的16S rRNA基因含有4个高变区,这些高变区的序列具有种或属的特异性,依据序列的相似程度构成的进化树可将立克次体目内成员分为柯克斯体、巴通体、立克次体、埃立克体等4个大基因群,每个大基因群含有若干个小基因群.结论 16S rRNA基因高变区的序列可用于设计立克次体种、属特异性PCR引物和杂交探针;16S rRNA基因序列的分析是目前立克次体分类和鉴定的可靠依据.
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常见分枝杆菌种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析结果的比较
目的 针对常见分枝杆菌不同株对其基因序列进行分析,比较分析结果.方法 利用16S rRNA Gene和16S-23S rRNAITS(转录间隔区序列)分析法分别对97株共7种DSMZ/ATCC引进的常见分枝杆菌进行种内不同株之间基因差异性分析,对比两种分型结果的异同.结果 16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3个型别,18株偶发分枝杆菌分为6个型别,17株耻垢分枝杆菌分为4个型别,8株戈登分枝杆菌分为3个型别,9株龟分枝杆菌龟亚种分为3个型别,15株堪萨斯分枝杆菌分为2个型别,17株产鼻疽分枝杆菌分为1个型别；而16S-23S rRNA ITS可依次将上述分枝杆菌分为3个、15个、7个、3个、4个、3个、5个型别.结论 16S rRNA G ene分析和16S-23S rRNA ITS分析均是分枝杆菌基因型分析的可靠方法,此外,16S-23SrRNA ITS的种内多态性高于16S rRNA Gene.
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54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析
目的 分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考.方法 用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比.结果 除11株(共9种4组)分枝杆菌.即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌；溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌；堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株(共41种)分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别.结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足.
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RT-PCR检测16S rRNA基因片段对麻风菌活性的评价
目的: 探讨麻风病患者皮损组织中麻风菌16S rRNA基因片段判断麻风菌活性的应用价值.方法: 根据BI值和联合化疗(MDT)的疗期对27例麻风患者分组,以RT-PCR法检测皮损组织中麻风菌16S rRNA的特异性片段.结果: (1)无论BI高低,未经治疗的患者16S rRNA均为阳性.(2)MDT治疗、BI≥3～6者的11例患者中:有9例16S rRNA为阳性,MDT疗期小于和大于6个月的两组中均各有1例患者16S rRNA阴性.(3)MDT治疗、BI≤2的6例患者:有1例MDT小于6个月病人其16S rRNA阳性,其余5例患者16S rRNA均为阴性.结论: 随MDT治疗的进行,麻风菌16S rRNA阳性患者比例减少;诊断时BI值越低的患者中,经治疗后皮损中麻风菌16S rRNA阴转的比例增大,提示麻风菌16S rRNA与患者皮损中麻风菌活性具有相关性.
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PCR扩增测序法寻找中国麻风杆菌新种Mycobacterium lepromatosis研究
目的 了解中国目前传播的麻风杆菌中是否存在麻风杆菌新种.方法 对来自中国23个省市125例麻风患者皮损组织DNA,采用巢式PCR扩增麻风杆菌特异16S rRNA保守片段,PCR阳性产物直接测序,经BLAST进行序列比对.结果 完成测序的86例菌株经BLAST比对发现,扩增片段与来自巴西的麻风杆菌Br4923相似性达99％,未发现麻风杆菌新种M ycobacterium le promatosis;86例中64例16S rRNA序列的251位碱基存在变异(C-T),存在突变的菌株多为SNPⅢ型,不存在突变的为SNP Ⅰ和Ⅱ型.结论 未发现麻风杆菌新种,16S rRNA基因序列突变C251T与SNP分型有关,可提示不同基因型麻风杆菌的地理分布.
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利用荧光素原位分子杂交检验水样中嗜肺军团菌的研究
目的:利用针对嗜肺军团菌种特异性16S rRNA和军团菌致病基因-巨噬细胞感染增强因子(mip)序列探针原位分子杂交建立嗜肺军团菌的快速、特异性检验方法.方法:设计特异性针对嗜肺军团菌种特异性16S rRNA和mip探针,采用荧光素标记探针对采自西安市8家宾馆中央空调冷凝水、贮水池水各8份进行原位分子杂交,并且结合细菌分离、生化鉴定技术检验水样中嗜肺军团菌.结果:细菌分离鉴定表明2份冷凝水、5份贮水池水分离到可疑菌落,抗体凝集实验证实嗜肺军团菌血清Ⅰ型3份、Ⅴ、Ⅵ型各1份,2份阴性.实验周期约10～12 d;原位分子杂交显示16S rRNA、mip的探针杂交信号成堆分布于原虫细胞内,形如杆菌状,16S rRNA与mip的杂交信号存在完全双标记,但有少数mip的杂交信号不与16S rRNA共存,5株鉴定为嗜肺军团菌Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ型的水样原虫中,经16S rRNA、mip探针杂交均为阳性,对2株非嗜肺军团菌水样原虫进行16S rRNA、mip的杂交结果均为阴性.实验周期约20 h.结论:结果表明该方法适用于对存在于原虫内致病性嗜肺军团菌进行检验,是种快速、特异性的致病性嗜肺军团菌检验方法.
关键词： 嗜肺军团菌 原位分子杂交 16S rRNA 巨噬细胞感染增强因子 鉴定 -
PCR在腹膜透析相关性腹膜炎中的应用
目的 探讨PCR在腹膜透析相关性腹膜炎(PDAP)诊断中的应用价值.方法 收集2013年1月-2016年6月PDAP患者的腹膜透析液标本97例.分别用常规细菌培养方法和PCR方法检测,同时比较2种方法在PDAP诊断上的差异.结果 常规细菌培养方法的阳性率为42.3％(41/97),主要菌种为凝固酶阴性葡萄球菌(34.1％)、大肠埃希菌(17.1％)、金黄色葡萄球菌(12.2％)和肺炎克雷伯菌(9.8％).PCR法诊断PDAP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数分别为71.1％、97.5％、98.6％、58.2％、0.686.属符合率为94.9％,种符合率为74.4％.结论 PCR是一种敏感性和特异性均较高的快速诊断PDAP的检测方法,可用于培养阴性腹膜炎的辅助诊断.
关键词： 腹膜透析相关性腹膜炎 16S rRNA 腹透液培养 -
罕见非嗜肺军团菌的鉴定
目的 对非嗜肺军团菌进行分离培养和分子分型鉴定.方法 依据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(2006),对广州市海珠区公共场所集中空调冷却塔水进行军团菌检测.用常规分离培养法检测军团菌,进一步运用生化和血清学凝集试验、实时荧光PCR技术及16S rRNA基因、mip基因测序对菌株进行种属鉴定.结果 在BCYE平板上生长,在L-半胱氨酸缺失的BCYE平板及血平板中均不生长的菌株,通过实时荧光PCR技术及16S rRNA基因、mip基因测序鉴定为菲氏军团菌4株和釜山军团菌1株,这是本区首次从集中空调冷却塔水中检出的非嗜肺军团菌.结论 运用常规分离培养方法和分子生物技术相结合检测出菲氏军团菌和釜山军团菌(国内罕见)等多种军团菌种,同时提示海珠区公共场所集中空调冷却塔水存在非嗜肺军团菌污染;16S rRNA基因、mip基因核酸测序鉴定有助于发现军团菌新种.
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应用双重PCR和16S rRNA测序法鉴定河南省结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌
目的 探讨应用双重PCR技术和16S rRNA测序法鉴定非结核分枝杆菌的可靠性.方法 对178株临床分离菌株用结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(850 bp)和MT序列(361 bp),采用2对特异性引物进行扩增,并与标准菌株比较;对筛选出的非结核分枝杆菌用16S rRNA测序.结果 171株结核分枝杆菌临床分离株中,157株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的361 bp、850 bp 2条DNA片段,敏感性达97.8％,特异性为100％;3株只有890 bp一条DNA片段,是结核分枝杆菌复合群(MTC);11株初步认定是非结核菌,进一步用16S rRNA测序法测序,有5株为非结核分枝杆菌(NTM).结论 应用多重PCR方法和16S rRNA测序法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果准确、可靠,具有很好的应用价值.
关键词： 多重PCR 16S rRNA 结核分枝杆菌 非结核分枝杆菌(NTM) 鉴定 -
16S rRNA基因序列法对30例泪囊炎致病细菌的鉴定
背景 泪囊炎是眼科常见的感染性疾病,对泪囊炎致病菌检测的金标准为培养法,在培养法的基础上结合分子生物学的检测方法可以更精确地鉴定出致病菌的种属,但目前眼科领域类似的研究资料比较缺乏.目的 采用PCR法扩增细菌核糖体16S rRNA基因序列鉴定泪囊炎病原细菌的种属.方法 取10例质控标准菌样本,利用PCR的加热过程使细菌核酸释放,扩增出细菌16S rRNA基因序列,测序后与GenBank中的基因序列进行比对,鉴定出细菌的种属信息,与生化鉴定法结果进行对比,确定16S rRNA基因检测方法的可靠性.取30例泪囊炎患者泪囊分泌物培养出的细菌,利用上述方法进行病原菌鉴定.结果 10例质控标准菌样本经PCR扩增后其产物序列的鉴定结果与生化鉴定法结果完全一致.30例泪囊炎病原细菌标本中,16S rRNA基因序列法鉴定结果为表皮葡萄球菌13例,沃氏葡萄球菌2例,人葡萄球菌1例,麦氏棒杆菌5例,肺炎链球菌3例,蜡状芽孢杆菌2例,藤黄微球菌1例；卡他莫拉菌1例,奥斯陆莫拉菌1例,铜绿假单胞菌1例.结论 通过PCR扩增细菌核糖体16S rRNA基因序列鉴定泪囊炎病原细菌种属的方法准确性高,特异性强.
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藻类及陆生高等植物叶绿体16S rRNA基因进化谱系及同源性分析
目的:了解杜氏盐藻与其他藻类和高等植物间的亲缘关系.方法:将杜氏盐藻的叶绿体16S rRNA序列与一些藻类和陆生植物叶绿体的16S rRNA序列资料进行同源性比较与分析,并构建进化树.结果:进化树显示整个植物界明显分为3个大的类群:蓝藻门、红藻门、隐藻门、金藻门、褐藻门、硅藻门和甲藻门形成一个类群,裸藻门单独形成一个类群,而绿藻门和陆生高等植物共同形成一个大的类群.陆生高等植物间的亲缘关系非常近,拥有一个共同的绿藻祖先,而杜氏盐藻、莱茵衣藻等所归属的团藻目则与其他绿藻及高等植物分离,独立形成一个极为分散的类群.结论:杜氏盐藻所隶属的团藻目属于较为原始的绿藻,彼此之间亲缘关系较远,而且与进化主干上的其他绿藻及高等植物较早分离.
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杜氏盐藻叶绿体16S rRNA基因的克隆
目的:克隆和鉴定杜氏盐藻叶绿体16S rRNA基因.方法:根据衣藻、小球藻等绿藻叶绿体16S rRNA基因序列,利用软件分析找出其高度保守区,据此设计引物,PCR扩增杜氏盐藻叶绿体16S rRNA序列,并与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivide进行同源性比较.结果:序列分析表明所克隆的序列1110bp与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivide 4种绿藻的序列同源性分别为85.0%、79.9%、81.3%和81.6%.结论:本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体16S rRNA基因.
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杜氏盐藻叶绿体转化载体pDS16S-CAT的构建
目的:利用同源重组方法,将外源基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)转入杜氏盐藻叶绿体中.方法:以杜氏盐藻叶绿体16S rRNA序列为同源片段,构建盐藻叶绿体表达载体,并利用基因枪法转化盐藻,使CAT基因得到表达.结果:转化后的盐藻可以在含有氯霉素的培养基中生存3～4周,表明CAT基因已转入盐藻叶绿体中并表达.结论:盐藻叶绿体转化是可行的,为获得稳定转化的盐藻,需要合适的同源片段.
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纳米细菌及其诱发泌尿系结石形成的研究进展
泌尿系结石是泌尿外科常见疾病.近年来.我国泌尿系结石的发病率有逐渐增加的趋势,对于结石的病因与发病机制的认识也经历了一个很长的过程,但仍然无法得出一个完整的定论.20世纪90年代后,纳米细菌的发现使人们对于泌尿系结石的形成过程有了新的认识.但纳米细菌是否作为一个真实的生命体,以及如何导致相关疾病的发生等方面仍存在很大的争议.本文旨在介绍纳米细菌的本质及其独特的生物作用,综述纳米细菌近年来的研究进展,讨论纳米细菌作为泌尿系结石的发病因素在临床上的应用并作出展望.
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16S rRNA克隆文库法分析成人龋病唾液微生物多样性
目的:讨论汉族人群中高龋和无龋人群口腔唾液微生物结构的差异.方法:采集符合WHO采样标准的唾液样本6例,其中高龋组(CA组)3例,无龋组(CF组)3例,提取细菌总DNA,构建16S rRNA克隆文库,挑取阳性克隆子进行测序,并用MOTHUR等软件对结果进行分析,MEGA4.0软件构建系统发育树.结果:共获得80个OTUs,归属于5个门,9个纲,10个目,14个科,19个属,其中有13个优势属;CA组优势属为:链球菌属(53.16％)、普氏菌属(28.77％)、颗粒链球菌属(9.34％);CF组优势菌为:链球菌属(46.12％)、普氏菌属(23.41％)、奈瑟菌属(14.35％).结论:16S rRNA克隆文库法已成熟,可用于口腔微生物群落结构的研究,当地汉族人群中高龋和无龋人群口腔微生物群落结构存在一定的差异,高龋组中优势菌(链球菌属、普氏菌属、颗粒链球菌属)对龋病发生发展的作用还有待进一步的研究.
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甘肃东乡及裕固族牙周炎口腔微生物群落结构研究
目的:研究甘肃东乡族和裕固族成年人牙周炎唾液微生物群落结构.方法:构建16S rRNA克隆文库对测序结果进行分析,DP(东乡族样本),YP(裕固族样本).结果:发现链球菌属存在于所有样本中;伴放线放线杆菌属(DP:0.00％,YP:3.30％)、奈瑟菌属(DP:10.40％,YP:3.60％)及韦永球菌属(DP:0.40％,YP:3.85％)在两组样本中的分布具有明显的差异(P＜0.05).结论:甘肃东乡及裕固族牙周炎口腔微生物群落结构存在一定差异,其中,链球菌属、普氏菌属、梭杆菌属及嗜血杆菌属在牙周炎患者口腔中的作用值得进一步研究.
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PCR-DGGE初步分析双胞胎儿童牙菌斑细菌群落组成
目的:应用PCR-DGGE技术对双胞胎儿童牙菌斑细菌群落组成进行初步分析.方法:牙菌斑样本取自6对双胞胎儿童,年龄3.5～5.5岁,共17份.分别提取细菌总DNA,PCR扩增16S rDNA V3可变区,产物经DGGE指纹图谱分析其组成.结果:DGGE图谱显示,无龋和患龋双胞胎儿童牙菌斑菌属分布存在差异.结论:PCR-DGGE技术可较直观、灵敏地反应牙菌斑菌属的组成情况.
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中间普里沃菌在成人牙周炎患者龈下菌斑中的分布
目的研究中间普里沃菌在牙周炎病人病变部位和健康部位龈下菌斑中的分布.方法选择64例成年人牙周炎患者,分别取病变部位和健康部位龈下菌斑,经厌氧培养,挑取产黑色素菌落,经多聚酶链反应鉴定中间普里沃菌.结果共对614株产黑色素G-厌氧杆菌进行多聚酶链反应鉴定,有112株被鉴定为中间普里沃菌;在病变部位和健康部位,中间普里沃菌的检出率分别是28.1%和12.5%,有统计学差异(P<0.05);在病变部位和健康部位,中间普里沃菌的检出株数分别是79和33,占产黑色素G-厌氧杆菌分离数的21%和13.9%,有统计学差异(P<0.05).结论中间普里沃菌是可疑的牙周致病菌.
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16S rRNA基因应用研究进展
16S rRNA分析的实验技术为微生物生态学的研究提供了新的研究方法,因此越来越多的学者利用16S rRNA进行各种实验的研究并取得了骄人的成绩.本文对16S rRNA基因的获得做一简单介绍,重点介绍16S rRNA基因的应用.16S rRNA在细菌菌种鉴定、环境保护、疾病诊断等方面都取得了很好的研究进展,不久的将来16S rRNA基因将会为人类做出更大的贡献.
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1株沙门样大肠埃希菌的分离与鉴定
目的 对1株与沙门菌抗血清发生交叉凝集的肠道菌分离株进行鉴定.方法 分别通过生化培养、抗血清凝集试验与16S rRNA序列比对分析,对该菌株进行鉴定.结果 该菌株的分离培养、生化代谢特征均与大肠埃希菌一致,但能与沙门菌属多型、群特异性抗血清发生凝集,与大肠埃希菌抗血清无凝集反应.序列分析结果表明,该菌株16S rRNA与大肠埃希菌一致,与沙门菌属存在明显差异.结论 本实验分离获得1株具有沙门菌血清凝集特征的大肠埃希菌.
