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甲型流感病毒DNA疫苗的小鼠免疫效果
目的 观察甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因DNA疫苗的小鼠免疫效果.方法 提取甲型流感病毒DNA疫苗质粒.将BALB/c小鼠随机分成流感裂解疫苗对照组、空载体pVAXI对照组、pVAX/GM-CSF对照组、pVAX/M2实验组、pMIG实验组,按0、2、4程序免疫BALB/c小鼠,第一针免疫后1周,定期对小鼠眼眶采血.用血凝抑制(HI)试验检测特异性抗体,流式细胞术双标法检测脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子数量,ELISA方法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的含量,并进行保护性试验.结果 流感裂解疫苗对照组HI平均值均＞40,产生了特异性血凝素抗体,其余各组均未检测到抗体;流感裂解疫苗组具有较强的刺激淋巴细胞增殖的作用,各组间T淋巴细胞表面CD4+及CD4+/CD8+的水平比较,差异有统计学意义;DNA疫苗组可刺激机体产生较高水平的细胞因子,且保护率较流感裂解疫苗对照组提高了一倍.结论 甲型流感病毒DNA疫苗可诱导小鼠的免疫应答,且细胞免疫水平显著高于流感裂解疫苗.
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甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析
目的构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体并分析插入的M2基因序列.方法从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因.通过分子克隆技术将所扩增片段克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+).经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的M2基因序列进行分析.结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功.序列分析有4个氨基酸出现变异,提交Genbank进行Blast 比对显示同源性97%(Genbank/NCBI AY768951).结论 M2四聚体蛋白具有H+通道功能,能够协助病毒与宿主细胞膜融合后释放RNP复合体,还能稳定HA蛋白的结构.M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口.该结果将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础.
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江西省季节性A(H1N1)流感病毒的基因特点及耐药性分析
目的 分析江西省2005年-2009年季节性H1N1流感病毒M2以及NA基因的特点,掌握其耐药情况,为流感防控提供参考.方法 从江西省流感监测网中随机选择26株季节性A (H1N1)流感病毒,经核酸提取和one-step RT-PCR扩增M以及NA基因片段,双向序列测定,采用DNAStar 5.0和Mage 4.0序列分析软件分析M2以及NA基因特征以及耐药性位点.结果 除2005年分离的3株病毒和2009年分离的2株病毒的M2基因重要位点未发生变异外,其他21株病毒均发生了S31N的氨基酸替换;2009年的5株分离株均发生H274Y突变外,其他21株病毒NA蛋白催化活性位点和辅助位点均未发生氨基酸替换.结论 2005年分离株均对奥司他韦敏感,部分毒株对金刚烷胺类药物耐药;2006年-2008年的分离株对金刚烷胺类药物耐药,但对奥司他韦敏感;2009年的分离株均对奥司他韦耐药,部分毒株对金刚烷胺类药物也耐药,应加强流感病毒耐药性监测.
关键词： 季节性A (H1N1)流感病毒 M2基因 NA基因 耐药性 -
甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达
目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体.体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达.方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因.通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+).经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达.结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功.免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达.结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白.甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础.
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靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义
目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因mRNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染HEP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率.结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建了针对RSV M2基因mRNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段.
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上饶市2013-2014年新型甲型H1N1流感病毒耐药性分析
目的 分析上饶市2013-2014年甲型H1N1流感病毒M2基因以及NA基因的特点,掌握其耐药情况,为临床治疗和疾病控制提供参考.方法 从上饶市流感监测网中随机选择12株甲型H1N1流感病毒,经核酸提取和one-step RT-PCR扩增M基因及NA基因片段,M基因经双向序列测定,采用DNAStar6.0和MEGA6.0序列分析软件分析M2基因特征以及耐药性位点;NA基因采用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)方法分析NA基因第275位是否发生酪氨酸(Y)替代组氨酸(H)的突变.结果 12株新型甲型H1N1流感病毒毒株M2基因31位氨基酸均由丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N);NA基因第275位氨基酸均为组氨酸,未发生变异.结论 12株新型甲型流感病毒毒株均对金刚烷胺类药物耐药,而对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦敏感.
关键词： 新型甲型H1N1流感病毒 M2基因 NA基因 耐药性
