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孕妇血浆中胎儿游离核酸Y染色体STR复合扩增的应用
目的:探讨利用孕妇血浆中游离胎儿DNA通过复合扩增Y染色体上的STR进行胎儿性别鉴定及其应用在产前无创性亲子鉴定中的可能性.方法:收集23例12-28孕周的孕妇外周血以及血浆,同时收集胎儿羊水标本以及可疑父亲的外周血标本,提取DNA,利用ABI Identifiler以及ABI Yfiler扩增系统复合扩增常染色体以及Y染色体上的STR位点,扩增产物经ABI 3130基因测序仪分析,用GeneMapper ID 3.2软件分析.结果:23例孕妇中,有16例孕妇经羊水Identifiler系统验证为男性胎儿,该16例孕男胎的孕妇血浆DNA的Y染色体STR位点扩增成功率100％,扩增出位点数目5-12个不等；并将其分型结果与羊水标本相比较,结果均一致；同时将其与可疑父亲的Y染色体STR位点分型结果相比较,在9例经ABI identifiler验证为非父子关系的案例中有8例可以成功排除其父子关系.结论:利用位于Y染色体上的STR位点进行多位点复合扩增可以明显提高胎儿性别鉴定的准确率,同时将其应用于产前无创性亲子鉴定中,可用于亲缘关系的初步排除.
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母体血浆胎儿游离DNA Rh D基因型产前诊断检测
目的 运用荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,Q-PCR)技术检测Rh D阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿Rh D基因型.方法 通过微量DNA抽提技术,并利用琼脂糖凝胶电泳法富集孕妇血浆游离胎儿DNA(Cell-free fetal DNA,cff DNA),用Q-PCR技术检测43例Rh D阴性孕妇血浆cff DNA,测定不同孕期的孕妇全血和血浆中管家基因(β-actin)的含量,比较不同孕期孕妇全血和血浆DNA含量的变化;并用男性性别决定基因(sex-determining region Y gene,SYR)确定胎儿DNA的存在,以未有妊娠史的健康女性和健康男性作为阴性和阳性基因对照;同时对孕男胎的Rh D阴性孕妇血浆cff DNA进行Rh D基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,与孕妇产后采集的新生儿脐血Rh D定型结果 对比分析.结果(1)孕妇早、中期孕组血浆DNA含量差异无统计学意义(P>0.05),早、晚期和中、晚期孕组血浆DNA差异有统计学意义(P<0.05).(2)43例Rh D阴性孕妇中26例经产后证实为男胎,母血浆中检测到SYR基因特异性扩增的25例,灵敏度为96.15％,特异度为94.44％,准确率为97.67％.(3)26例孕男胎孕妇血浆中胎儿DNA的Rh D基因型检测发现,有19例胎儿Rh D血型阳性,5例胎儿Rh D血型阴性,即24例胎儿DNA的Rh D基因型与表型相符,准确率为97.6％.结论 运用Q-PCR技术检测Rh D阴性孕妇血浆中cff DNA进行无创性产前诊断胎儿Rh D基因型,是一种敏感性高、特异性好的无创性产前诊断方法,可用于临床诊断和预防新生儿Rh D溶血病.
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实时PCR和cycling probe技术检测母血浆游离胎儿DNA筛选重型β地中海贫血胎儿
目的 通过检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA来筛选重型β-地中海贫血胎儿.方法 选择行产前基因诊断的夫妇6对,孕妇孕周23～26周.血液学检查:胎儿的父亲均为β-地中海贫血17M/N型,孕妇本人为携带除17M/N型之外的另一β-地中海贫血突变类型.针对CD17(A→T)无义突变,设计β-珠蛋白肽链上该等位基因的一对特异性引物和通过cycling probe法分别设计检测正常基因序列和基因突变位点的两条荧光探针,分别用FAM和HEX荧光标记.结合RT-PCR技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA,诊断胎儿是否遗传了其父亲的β地中海贫血17M/N碱基突变位点.同时与脐血血液学检查所诊断的胎儿地贫基因型对照.结果 提取的6例孕妇血浆DNA模板中有3例同时显示FAM和HEX荧光信号值阳性结果,即这3例孕妇的胎儿遗传了父亲β-珠蛋白肽链上CD17位点的突变碱基(A→T).另外3例孕妇血浆DNA模板的FAM信号值阳性,HEX信号值阴性,即所孕胎儿没有遗传父亲的CD17位点的突变碱基.结论 利用RT-PCR和cycling probe技术检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA可用来筛选患重型地中海贫血的胎儿.
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利用孕妇血浆中的胎儿DNA进行β-地中海贫血的产前诊断
目的 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA(cffDNA)对广东省常见17种β地中海贫血的突变基因进行扩增,探讨非创伤性产前诊断β-地中海贫血的可行性.方法 ①羊水途径:抽取孕妇羊水共9例,采用反向斑点杂交技术检测中国人群8个常见位点和9个少见位点突变的共17种β地贫基因；②抽取孕妇外周血,柱分离法提取及凝胶回收纯化DNA,设计3对引物,对cffDNA进行二次PCR,反向斑点杂交技术检测β地中海贫血的突变基因.结果 9例孕妇中有5例经羊水检测证实胎儿有父系的β地贫基因,有2例孕妇外周血中检测到胎儿（父系）β地贫基因,与羊水检测相符.结论 利用cffDNA进行β-地中海贫血的检测方法可行,但由于母源性DNA背景的污染,以及胎儿DNA因含量而导致检出率低,希望进一步改进该技术后有望可用于β-地中海贫血的诊断.
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男性胎儿DNA含量低的孕妇的无创产前检测
目的 探讨外周血中胎儿DNA含量低的孕妇的无创产前检测(NIPT).方法 回顾分析2015年4月至2016年3月间在佛山市妇幼保健院行NIPT的3240例孕妇实验数据与随访资料,根据其Y染色体z值,筛选出胎儿为男性且胎儿DNA含量低于8%的样品共150例,利用琼脂糖凝胶电泳富集法提高胎儿DNA含量,进行NIPT,对比非整倍体筛查结果的准确率.结果 琼脂糖凝胶电泳富集法将样品中的胎儿DNA含量从平均5%提高到9.2%.对比胎儿DNA含量提高前后的NIPT结果是一致的.结论 当胎儿DNA含量高于5%时,胎儿DNA含量不会影响NIPT结果的准确率.
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ERG甲基化位点检测技术在无创性产前诊断中的应用
目的 通过检测和分析游离胎儿DNA的 ERG基因在不同孕期中浓度的变化,探讨利用ERG甲基化位点检测技术应用于无创性产前诊断的可行性.方法 随机选取健康妊娠妇女早孕组、中孕组、晚孕组各30例.采用 HpaⅡ、MspⅠ分别对血浆中提取的游离DNA酶切后进行SYBR PCR反应,通过检测ERG基因甲基化位点,定量分析不同孕期的孕妇血浆中游离胎儿DNA浓度.结果 游离胎儿DNA的ERG基因在孕妇血浆中的浓度随着孕周的增长而升高.各孕周组的母血浆中ERG基因浓度(LG copies/mL)中位数分别为5.38,6.10和7.04(χ2 =75.104,P<0.01).结论 本研究证实了游离胎儿DNA的ERG基因序列上CCGG位点存在甲基化的特性.进一步确定了ERG基因作为胎儿DNA的标记物应用于无创性产前诊断的可行性.
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孕妇血浆胎儿游离DNA检测对胎儿染色体拷贝数异常的诊断意义
目的 探讨应用孕妇血浆胎儿游离DNA高通量基因测序技术检测胎儿染色体拷贝数的准确性和实际临床可行性.方法 选择需做产前诊断的153名孕妇,采用高通量基因测序技术检测母体血浆胎儿游离DNA,分析胎儿染色体拷贝数;同时行羊膜腔穿刺进行胎儿染色体核型分析.结果 153名孕妇中,母体血浆游离DNA平行测序技术共检测出6例染色体异常高风险胎儿.羊水分析证实6例均为染色体异常,其中非整倍体5例,分别为47,XYY; 45,X;47,XY,+18;47,XY,+21以及47,XY,+13;染色体结构异常1例,核型为46,XY,der (13; 21)(q10; q10),+21.另检出染色体多态性3例(1例46,XY,21p+;2例46,XY,Yqh-).两种方法检测胎儿染色体拷贝数异常结果一致.结论 母体血浆游离DNA高通量测序分析可以用于胎儿染色体拷贝数异常的检测,具有无创、灵敏度高、特异性强等优点,在胎儿染色体拷贝数异常疾病的产前检测中具有广泛的应用前景.
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用羊水悬液中游离胎儿核酸检测胎儿染色体异常
目的 建立一种胎儿染色体异常的快速产前检测方法.方法 用高通量测序技术对25份羊水悬液标本(染色体核型分析包括10例染色体非整倍体,2例染色体结构异常以及13例正常核型)进行检测,检测结果与传统羊水核型技术分析结果相比较.结果 高通量测序技术可以在3 mL羊水悬液中准确检测胎儿染色体非整倍体,但对于平衡染色体结构异常缺乏检测能力.结论 高通量测序技术可作为一种快速产前诊断方法,对胎儿染色体异常进行诊断.它与传统的染色体核型分析技术相结合,可提高产前对胎儿染色体检测的速度和精度.
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非侵入性产前诊断方法的研究进展
非侵入性产前诊断方法包括超声检查、母体血清标记物筛查、母体外周血中胎儿细胞的富集和分析、母体外周血中游离胎儿DNA的提取和分析等.各类技术近年来发展很快,本文就其研究进展和临床应用加以综述.
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唐氏综合征高危孕妇血浆中游离胎儿DNA的Y染色体微缺失筛查
目的 利用孕妇血浆中游离胎儿DNA在孕早期进行Y染色体微缺失筛查,诊断男性胎儿无精子症因子(AZF)缺失情况.方法 留取2013年6月～2014年8月参加产前检测的16～34孕周唐氏综合征筛查高危孕妇的外周血标本89例,提取出全血基因组DNA后利用Y染色体微缺失检测试剂盒检测AZF微缺失.结果 86例孕妇妊娠至胎儿出生,其中男胎孕妇45例,女胎孕妇41例.妊娠女性胎儿的孕妇血浆DNA仅扩增出ZFX/ZFY对照基因,而妊娠男性胎儿的孕妇血浆DNA同时扩增出SRY,ZFX/ZFY对照基因,且有3例样本检测出AZF基因微缺失.结论 通过提取孕妇血浆中游离胎儿DNA能够检测出胎儿是否伴有AZF基因微缺失,从而提前预测胎儿今后罹患生精障碍的风险.
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母血中胎源性RASSF1A基因的检测及其在子痫前期中的临床意义
目的:初步探讨孕妇血浆中胎源性Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)基因的动力学特点及其在子痫前期中的含量变化.方法:应用2种甲基化敏感的限制性内切酶HinP1I和HhaI去除孕妇血浆中非甲基化的RASSF1A序列,保留超甲基化RASSF1A序列.通过含目的基因的质粒标准品绘制标准曲线,结合荧光定量PCR(FQ-PCR)技术测定血浆中酶切后RASSF1A基因的含量,反映游离胎儿DNA水平.同时检测β-actin基因确保酶对非甲基化序列的完全消化.结果:①早可在妊娠7<'+3>周检测出孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因;②孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因的含量随妊娠的进程逐渐增加,且在分娩后24 h内消失;③未妊娠组中均未检测到超甲基化的RASSF1A基因;④妊娠晚期子痫前期组超甲基化RASSF1A基因含量为正常同期妊娠组的3.52倍.结论:孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因可以作为胎儿表观遗传学标志物,其水平的异常变化或能提示子痫前期-子痫的发生.
