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2009—2016年上海人冠状病毒OC43分子流行病学研究
目的 分析上海2009年11月至2016年4月人冠状病毒(HCoV)流行特征,以及HCoV-OC43基因型分布和变异变迁规律.方法 收集2009年11月至2016年4月期间上海7家哨点医院感染科急性呼吸道感染患者的临床资料和呼吸道样本,包括咽拭子、痰、鼻咽抽吸物和肺泡灌洗液,共6059例.采用HCoV通用引物对患者样本进行检测并测序分型.HCoV-OC43阳性样本进一步采用特异性引物对刺突蛋白、依赖RNA的RNA聚合酶(RDRP)和核衣壳蛋白全基因进行扩增和测序,并通过全基因序列构建进化树对HCoV-OC43进行基因分型和进化分析.结果 共检出HCoV 63株(1.04%),其中HCoV-OC43检出数多,为34株,其后依次是HCoV-229E和HCoV-HKU1,检出数分别为18和10株,而HCoV-NL63、重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均未检出.29例HCoV-OC43阳性样本获得刺突蛋白、RDRP和核衣壳蛋白全基因序列,根据进化树分析显示,其中27例为D型,2例为B型,而其他基因型E、F、G均未检出,其中D型为主导基因型.进一步分析与HCoV-OC43进入宿主和中和抗体产生相关的刺突蛋白发现,刺突蛋白重要的功能结构域——N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)含有较多氨基酸变异和阳性选择位点,并伴有氨基酸插入/缺失.13个阳性选择位点均位于NTD或RBD,其中10个位于NTD,3个位于RBD.结论2009—2016年,上海流行的HCoV主要为HCoV-OC43,其中D型为优势基因型.刺突蛋白的NTD区和RBD区是HCoV-OC43进化过程中的高变区域,伴有氨基酸替换、氨基酸插入/缺失.
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人冠状病毒OC43在北京成人呼吸道感染患者中感染的初步分析
目的 调查北京地区成人上呼吸道感染患者中人冠状病毒(HCoV-OC43)的感染状况,了解HCoV-OC43的流行分布和临床表现特点.方法 针对主要结构蛋白S与N分别设计引物,建立两套一步法逆转录PCR检测方法,并对559份采集自2011年1月至2012年1月北京地区成人呼吸道感染患者的鼻咽拭子标本进行HCoV-OC43筛查;同时对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查,并进一步分析HCoV-OC43感染的流行病学和临床表现特点.结果 559例鼻咽拭子样本中检测出HCoV-OC43阳性70例(12.52％,95％可性区间:9.78％ ～ 15.26％);秋季是其流行季节,而性别和各年龄段(青年,中年和老年)HCoV-OC43的发病率没有差异;HCoV-OC43感染患者的临床表现主要是发热、咽痛、头痛、咳嗽、鼻塞、流涕等,其中8例患者出现呕吐或腹泻,鼻塞是HCoV-OC43感染的特异性临床表现;有25例(35.71％,25/70,95％可性区间:24.49％-46.93％)与其他常见呼吸道病毒共感染.结论 采用双靶标核酸检测方法与鼻咽拭子检查结果表明,近年北京地区成人急性呼吸道感染患者中HCoV-OC43检出率为12.52％.
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一种新型冠状病毒基因的克隆和序列分析与传染性非典型肺炎病原学的调查
目的探讨冠状病毒感染与传染性非典型肺炎发病的关系,分析冠状病毒基因序列变异的临床意义,建立诊断冠状病毒变异株感染的分子生物学方法.方法收集非典型肺炎(SARS)患者的不同临床标本,采用PCR技术分别进行衣原体、甲肺炎病毒以及冠状病毒等的基因检测.以冠状病毒相对保守的依赖RNA的RNA多聚酶基因为靶基因,采用Nested RT-PCR技术从非典型肺炎患者的鼻咽吸取物标本和漱喉液标本中扩增出冠状病毒基因,将PCR产物直接克隆到T载体,进行序列测定,进一步比较不同分离株间的核苷酸和氨基酸序列同源性.结果在27例非典型肺炎患者中检出冠状病毒基因阳性6例,阳性率为22.2%.而在15例健康对照中,全部阴性.采用BLAST软件将所获得的冠状病毒的基因序列与基因库(GenBank)登记的序列比较,结果显示本次分离克隆的冠状病毒基因与既往报道的所有冠状病毒在核苷酸水平没有相关性,核苷酸同源性高不超过40%.但在氨基酸水平的同源性为80%左右(70%～82%).从不同患者中分离的冠状病毒基因之间在核苷酸水平的同源性在98%以上.与刚刚公布的加拿大、中国香港、英国等SARS冠状病毒的核苷酸序列同源性在99%以上.结论相当部分非典型肺炎患者存在冠状病毒的感染,提示本次的非典型肺炎发病与感染冠状病毒有关.序列分析结果表明从本次非典型肺炎患者中分离的冠状病毒为一种新的冠状病毒,并与世界其他地区分离的SARS冠状病毒同源性达99%以上.以RNA多聚酶为靶基因Nested RT-PCR技术可以用于诊断这一新种冠状病毒感染.
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从临床呼吸道样本直接扩增人冠状病毒OC43全基因组序列方法研究
目的 针对普通人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)基因组较大、难以分离培养的特点,建立无需分离、直接从微量临床呼吸道样本中扩增HCoV-OC43全基因组序列的PCR方法.方法 从HCoV-OC43检测阳性的鼻咽洗液样本中提取核酸,用逆转录的方法获得病毒cDNA,根据GenBank中HCoV-OC43序列设计一整套合成扩增引物,根据样本PCR扩增结果进行引物序列和扩增条件的优化,序列测定后进行拼接和序列特点分析.结果 建立了基于普通PCR方法的HCoV-OC43全基因组序列扩增体系,利用200μl呼吸道样本可完成全基因组序列的扩增和验证,并成功从60份临床样本中获得40株全基因组序列.结论 所建立方法可利用微量呼吸道样本获取HCoV-OC43病毒全基因组序列,为系统分析HCoV-OC43的基因组变异和进化特征提供了简单易行的技术方法.
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用RT-PCR法鉴定人冠状病毒SARS、229E和OC43
目的:建立两种简单、快速和特异性的RT-PCR法鉴定SARS-HCoV、HCoV-229E和HCoV-OC43.方法:用DNA Star和Premier 5.0软件设计SARS-HCoV、HCoV-229E和HCoV-OC43及其它冠状病毒针对保守区Pol1 b基因的一对通用引物和分别针对M基因的3对引物,然后通过对扩增片断测序、限制性酶切方法和根据扩增片断的长度进行鉴定.结果:两种方法均能扩增到与预期目标一致的片断,特异性和灵敏度高,能快速区分3种病毒.结论:这些方法将为了解冠状病毒在呼吸道感染中的作用提供一个有利的工具.
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六重荧光RT-PCR快速检测A、B型流感等呼吸道病毒方法的建立
目的 利用六重荧光RT-PCR法建立起一种快速检测A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的方法.方法 根据A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的保守序列,设计相应的引物和Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒优化反应体系后,采用十倍稀释体外转录RNA检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量的标准曲线;利用具有多种相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的检测灵敏度为100 copies/μL,标准曲线的相关系数都在99%以上,重复性良好,特异性实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的六重荧光RT-PCR技术可以快速、准确地检测A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒等六种呼吸道病毒.
