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2010年青岛市和临沂市急性出血性结膜炎疫情病原学鉴定与基因特征分析
急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)俗称红眼病,为季节性传染病,多发生在夏秋季,其病原主要是微小核糖核酸病毒科中的人肠道病毒70型(enterovirus 70,EV70)和柯萨奇病毒A组24型变异株(coxsackievirus A24 variant,CVA24v),腺病毒也可以引起AHC的流行[1].2010年山东省青岛市和临沂市出现AHC流行,报告病例数居全省前2位,笔者对AHC患者眼结膜拭子标本进行了病毒分离鉴定,现报告如下.
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两株田间重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定、进化分析及其致病性研究
为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV2) 田间毒株重组特征, 本研究对两株分离物 (HENXX-8、HENJY-2) 进行全基因测序、进化分析及毒力测定, 并对其全基因序列进行重组分析.结果显示, 两个毒株均属于PRRSV 2, 两者与其代表株VR-2332的核苷酸相似性分别为85.6％、85.7％;与高致病性PRRSV (HPPRRSV) 毒株JXA1、TJ和WUH4株分别为85.7％85.8％、85.4％85.5％;与经典毒株CH-1a、HB-2 (sh) 分别为84.7％85.7％、84.5％85.7％;而与所有NADC30类毒株均在90.0％以上.全基因、ORF5及Nsp2序列进化分析结果均显示两个分离物与国内报道的类NADC30毒株遗传距离较近, 同处于一个分支.全基因组重组分析结果表明, 两个分离毒株存在明显重组现象, 且重组模式均以类NADC30毒株为骨架病毒, 与HP-PRRSV毒株发生重组.但重组对象不同:HENJY-2是由类NADC30毒株与TJ株发生重组;而HENXX-8则是由类NADC30毒株与WUH4、TJ株发生3毒株间重组.由于重组部位序列缺乏特异性分子标志, 因此无法确定与类NADC30发生重组的是HP-PRRSV还是其减毒的疫苗毒株.两株分离物的重组部位与早期分离毒株HENANHEB、JL580等有所不同, 均未涉及到ORF5基因, 而是集中在Nsp1Nsp2以及ORF2aORF3区域, 主要发生在病毒基因组的靠5#端 (307 000bp) 和3#端 (11 00013 000bp) 处.对部分重要基因的核苷酸相似性分析结果显示, 两个分离株的ORF2a、ORF3基因与HP-PRRSV毒株相似性高, 表明重组病毒的这两个基因可能来自HPPRRSV毒株.致病性试验结果表明, 参考毒株HENXC-4的毒力略高于分离毒株HENXX-8, 主要表现在体温升高、日均增重降低和肺部病变上.但两个分离物均未引起发病猪死亡.以上结果表明, 目前PRRSV2在田间的基因重组事件存在随机性, 提示不同毒株在田间的存在会加剧PRRSV重组事件的发生和流行、毒株类型更加复杂, 从而增加了临床防控难度.因此, 慎重使用活疫苗并持续监测活疫苗毒株在田间的变异动态, 对更好防控本病具有一定的临床指导意义.
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多细胞株微量培养法在病毒性脑炎、脑膜炎患儿病原学检测的应用研究
目的 探讨多细胞株微量培养法在病毒性脑炎、脑膜炎病原学检测中的应用价值.方法 将脑脊液(CSF)标本过滤除菌后分别接种于含有青霉素和链霉素微量细胞培养板单层细胞上,每份标本平行接种8株细胞:MA104、MDCK、HEL、HEK293、Vero、Hep-2、Hela和BHK-21.静置培养,获得稳定的病毒株.以肠道病毒(EV)组合血清鉴定引起病毒性脑炎、脑膜炎的常见病毒类型.结果 126份病毒性脑炎、脑膜炎患儿CSF标本82份分离到病毒,阳性率63.0％,其中MA104阳性率为57.1％,MDCK阳性率为19.8％,HEL阳性率为11.9％,HEK阳性率为7.1％,Vero阳性率为6.3％,Hep-2阳性率为4.8％,Hela阳性率为4.0％,BHK-21阳性率为2.4％.病变细胞经血清学鉴定,78例鉴定出病毒株,鉴定率为92.8％,这些病毒中EV所占比例较高,为69.2％；ADV占11.5％,HSV-Ⅰ占5.1％,HSV-Ⅱ占6.4％；CMV占5.1％,INF占2.6％.结论 MA104细胞是分离CSF中病毒较敏感的细胞,可以作CSF中病原分离的首选细胞；联合多株细胞可提高细胞病变检出率.多株细胞微孔板培养法分离CSF病毒具有推广应用价值.
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猫疱疹病毒I型的分离与鉴定
目的 从临床疑似猫病毒性鼻气管炎的病例中分离猫疱疹病毒I型.方法 用猫肾细胞(FK-81)对临床疑似猫病毒性鼻气管炎病猫的眼鼻分泌物进行分离培养,连续传4代,对获得的培养物进行了电子显微镜观察、血凝试验、病毒核酸型试验、理化特性试验以及PCR扩增和扩增产物基因测序鉴定.结果 该病毒粒子呈球形,直径为160 nm左右,有囊膜.凝集猫红细胞,不凝集猪、兔、犬、小鼠和鸡的红细胞.病毒对乙醚、酸、热、胰蛋白酶敏感,其核酸型属DNA.PCR扩增为猫疱疹病毒I型阳性,扩增产物基因序列与Nunberg等报道猫疱疹病毒I型的基因序列同源性为100%(登录号:M26660).结论 在国内首次成功分离一株猫疱疹病毒I型,其形态、血凝性、理化特性、基因序列等与国外文献报道一致,为猫病毒性鼻气管炎病原学、疫苗免疫、诊断及分子生物学研究奠定基础.
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手足口病病原微生物EV71病毒株的分离与鉴定
目的:探讨手足口病病原体EV71病毒的分离方法.方法:取手足口病患儿的粪便,经磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后用0.22 μm滤膜过滤,将悬液接种于Vero细胞.通过EV71病毒致细胞病变效应(CPE)分析、电镜分析、EV71病毒特异性核酸及蛋白的聚合酶链反应(PCR)及Western Blotting分析来鉴定病毒分离和致病效果.检测病毒悬液对于宿主细胞Vero增殖抑制的效果.结果:标本悬液接种Vero细胞48 h后出现CPE.收集感染细胞的培养基上清液,连续感染2次,均出现同样的CPE.电镜检测发现在感染组Vero细胞的细胞质和细胞核周围均有大量聚集的病毒颗粒.EV71特异性核酸RT-PCR检测证实,感染组Vero细胞中可以扩增出EV71病毒特异性的核酸条带.Western Blotting检测发现,在感染组细胞中有高表达EV71特异性抗原蛋白,而未感染组细胞不表达该病毒抗原.MTT检测结果显示,EV71病毒显著抑制宿主细胞Vero的体外增殖和生长,并且呈时间依赖性.结论:成功分离出人手足口病致微生物EV71病毒株(该EV71病毒株编号为EV71-Tj-100623).
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2009-2010年濮阳市新甲型H1N1流感病毒检测分析
目的 在国家流感网络实验室平台框架下,通过对濮阳市2009-2010年流感感染人群流感病毒核酸的实验室检测,了解新甲型H1N1及其它流感病毒在濮阳市感染人群中病毒型别的构成,密切关注新甲型H1N1流感病毒变异情况,及时对病毒变异等重要情况进行分析,向国家流感中心提供重要检测数据,为甲型H1N1流感防控提供科学依据.方法 按照<甲型H1N1流感病毒RT-PCR检测技术标准操作规程>,使用Real-time RT-PCT和RT-PCR对病例鼻咽拭子标本进行甲型H1N1和季节性H1、H3和A、B型流感病毒核酸检测.结果 2009年5月-2010年12月共检测流感样病例标本776份,流感病毒核酸阳性386份,阳性率为49.74%.386份阳性标本中新甲型H1N1流感病毒核酸阳性226份,占流感病例阳性标本的比例为58.55%.2009年9月12日检出首例新甲型H1N1流感病毒核酸阳性病例,此后甲型H1N1流感病毒核酸阳性率持续上升,2009年11月份达到高峰,为73.11%,12月份后开始下降,2010年3月份后再未检出流感病毒核酸阳性病例.对125份流感病毒核酸阳性标本进行病毒分离,总体病毒分离阳性率较低,只有18.40%.结论 2009年秋季至2010年春季是本次流感大流行的高发季节,新甲型H1N1流感病毒为这波流感大流行的优势毒株.但季节性流感病毒也同时存在.
关键词： 新甲型H1N1流感病毒 流感样病例 病毒核酸检测 病毒分离鉴定 -
手足口病EV71病毒株的分离鉴定及其生物学特性研究
目的:为了获得肠道病毒71型病毒株,同时验证Vero细胞分离肠道病毒的效果.方法:采集手足口病例疱疹液、咽拭子标本,接种单层Vero细胞,观察细胞病变(CPE);CPE阳性的培养物用荧光定量RT - PCR方法进行鉴定及分型,选取毒株进一步做EV71 VP1全序列测定、电子显微镜形态学观察、间接免疫荧光染色、病毒CCID50测定.结果:从23例手足口病例33份标本中,分离到22株肠道病毒,分离阳性率为66.7％；其中肠道病毒71型17株占阳性数的77.3％,CoxA16型4株占18.2％,未分型1株占4.5％,经基因序列分析表明本次分离的肠道病毒71型毒株均为C基因型.结论:Vero细胞分离肠道病毒阳性率高,获得了17株EV71型毒株.
